酶联免疫吸附实验（elisa）系列讲座五

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1、 ELISA 系列讲座五ELISA 质量控制从 1949 年美国 College of American Pathologists（简称 CAP）首先开始研究临床实验室室内质量控制（简称质控）问题，美国学者 Levery 和 Jenn ing 于 1950年发表第一篇关于使用质控图的实验室室内质控，临床检验实验室的室内质控工作正式拉序幕。 到 70 年代，实验室质量控制进入一个新的阶段-全面质量管理，推行 Good Laboratory Parctice（简称 GLP）。进入 80 年代末期，GLP 的统一标准产生了，发展到 认证实验室 管理阶 段。 全面质量管理的宗旨在于预防差错的产生。质控

2、图的统计学质控的目的是检出差错。 统计学的实验室室内质控是全面质量管理中的一个重 要环节。 本章节主要介绍免疫学检验的统计学室内质控方法。因为 ELISA 是目前临床上最常用的一种免疫学检验方法，就以 ELISA 检验为例，介绍一下有关问题。 卫生部临床检验中心免疫质控室从 1988 年开始在全国范围内开展乙肝标志物检验的质量评价活动，一直采用这一套质量评价方法，并在实践中不断实践、提高和完善， 希望能找出一条适合中国国情的，行之有效的 质量管理的道路。 5.1 基本概念 5.1.1 质量控制（Quaility Control,Q.C） 质量控制是监视全过程，排除误差，防止 变化，维持 标准化

3、现状的一个管理过程。这 一过程是通过一个反 馈环路进行的。1）确定控制的对象；2）规定控制对象的标准（预期值）；3）制定或选择控制方法和手段；3）测量实际数据；4）比较或较对实际数据与预期值之间的差异，并说明产生这一差异的原因。超出预定误差范围，报警系发出信号，反 馈通道中断。5）采取行动，解决差异。恢复原状（原标准状态 ）的手段发挥作用。质量控制主要采用质控图进行。质控图是把某一检验的性能数据与所计算出来的预期的 控制限 进 行比较的图。这种性能数据是在按规程正常进行时，按时间顺序而抽选出来的，其目的是检测检验过程中变异的可追查 性原因。可追逆性的 误差原因，是指除去随机误差以外的其他原因。

4、控制限 是通过统计计算出来的，在后我们将详细 介绍（见 5 .3.室内质控程序）。5.1.2 误差 实验误差分为三种：系统误差、随机误差和过失误差。系统误差是指一系列测定结果与真值或靶值存在有同一倾向的误差，有明显的规律性，可在一定条件下重复出现，是可以通 过质 控预防和 校正的。随机误差又称偶然误差，是一种偶然的、未能预料到的误差，是 难以避免和校正的误差。检验工作中随机 误差的分布符合正态分布规律。过失误差是人为的责任误差。通过加强实验室管理和开展质量控制工作是可以避免的。5.1.3 正态分布及标准差 ELISA 试验中，检验同一样本达 20 次以上时，就会发现这组数据（指测定结果的吸光值

5、）分布在均值两侧，大部分集中在均值附近 。如果以测定值为横坐标，以出现 的频率为纵坐标作 图，就可 绘出一个呈钟形的曲线图。如 图 5-1，钟顶处为均值，其他值以均值为中 心对称分布， 这就是正 态分布。正态曲线以下的面积称概率，常用样本的均数（X）和标准差（SD）来表示，其计算方法如下： 均值、标准差和概率的关系如下：X1SD，概率 0.68X2SD，概率 0.95X3SD，概率 0.99换言之，当 ELSIA 检测同一样本达一定次数后所得的一组数据，其中靠近均值（X）的1SD 范围内的数据，占该组数据的 68%，在 X2 SD 范围内分布的数据占总体的 95%，在 X3SD 范围内分布的数

6、据占总体的 99%。当我们要求检验结果在 X2SD 范围内为 合 格时，将有 95%的数据可能合格。5.1.4 真值 用确切的、最理想的决定性方法测得的值，称 为真值。真 值一般是测不到的。通过可靠的决定性方法测 出的值，称 为靶值，通常用靶值来 表示真值的大小。5.1.5 准确度（accuracy ） 是指测定结果与真值（或靶值）接近的程度。准确度不能以数字表示，往往用不准确度来衡量。测定结果与靶值的偏离程度称为偏差，它 表示该项检验的不准确度。绝对偏差= 检验的均值 -真值（或靶值）相对偏差= 绝对偏差真 值（或靶值）100%5.1.6 精密度（Precision） 是指对同一样本重复测定

7、时，每次测定结果与平均值的接近程度，即重复测定值之间的符合程度。5.1.7 标准品 1、国际标准品由 WHO 或相应组织标定的，用肯定的、公认的、准确的物理或化学方法测定的定值材料。2、国际生物学活性标准品根据生物学反应由 WHO 或相应组织标定的国际活性单位的材料。3、参考标准血清国家标准化组织根据国际标准化生产的法定材料。可用于鉴定仪器和鉴定方法准确性。 5.1.8 临床决定性水平（clinical decision leuel） 当某个被测物的浓度达到某一水平时，临床医师必须采用医疗措施。被测物的这浓度称为临床决定性水平。5.2 质量控制血清 质控血清是已有靶值的血清，在每次的常规检验中

8、加入一份或数份，通过所得结果来了解本次检验的情况。质控血清检验的结果如能控制 其误差在一定范围内，就 说明该检验没有发 生不允许的误差。如果出现超过允许误差范围的异常结果，提示该检验不合格，应寻找原因， 纠正后，重检待测标本。因此质控血清在质控工作中起重要作用。5.2.1 质控血清的使用 卫生部临床检验中心制备的乙肝标志物质控血清，可以在 -20保持半年定值不变。冰 冻状态融化使用 时， 应先混匀，未用完部分可在 4保存 5 天。不宜反复冰融或自行分装。开展某项检验 的室内质控工作需要的质控血清，一般按 3-6个月用量准备。自制的不定 值质控血清，在一批 质控血清将用完之前，需准备下一批质控

9、血清。质控血清要求性能稳定， 较长期内效价不变，其理化性 质应与病人样本相近，这样才能有效地起到监测作用。 5.2.2 临界值质控血清 质控制血清分定值和未定值两种。如只用一份质控血清定值，一般定在正常值与异常值交界点上，定性 测定时处于弱阳性水平，称为临界 值。乙肝 标志物临界值的制定，应按临床要求，为临床提供统一的判断弱阳性的标准。 临界值质控血清可以作为试剂盒中的阳性对照品和 阴性对照品以外的第三个对照品，它可以灵敏地反映出试剂盒的检出水平，确保弱阳性反应的标本不漏检。 5.2.3 质控血清的制备 每个实验室可以根据自己的条件，选用临床中心提供的质控血清，或按以下方法自己制备本室使用的质

10、控血清（以乙肝质控血清为例）。1）收集新鲜的无溶血、无黄疸、无细菌污染的阳性血清。2） 56加热 10 小时来活。3） 离心或过滤除去沉淀。4） 用 10%的小牛血清或正常人血清（PBS 缓冲液）将收集的血清稀 释至所需的浓度。如能用正常的人血清稀释更好，因其成份更接近于检测标本。5） 抽滤除菌。按一次使用的量分装小安瓿，封口，20保存备用。不可反复冻融。被检物要求检出的水平常被认为是质控血清应选择的水平。如果该试验还有其它要求， 则应加所要求浓度的 质控物。6） 标定含量。20-30 次测定结果删除2SD 数据的均 值作为靶值，并与已知定 值血清对比测定。5.3 室内质量控制程序 临床检验的

11、检测结果，每次或每天之间不可能没有误差。决定允许的误差范围，以临 床上不造成误诊与漏 诊为准，通 过以下步骤 来确定质 控范围。1） 最佳条件下的测定误差。2） 已知值的血清在常规检验条件下的误差。3） 未知值的血清在常规检验条件下的误差。4） 临床应用的要求。对任何一个试验都应确定一个允许的误差范围，前题是满足临床要求。如允许误差定得过小，在 临床上不存在任何意义 ，但 为了符合该规定却要花费很大人力、物力和时间。相反，如果将允 许误差定得过大，将使监测系统察觉不到临床上要求检出的误差， 失去质控的意义。5.3.1 最佳条件下已知值质控血清变异（optimal conditions vari

12、ance,简称OCV）的测定 在本实验室最佳条件下（包括操作者、试剂、 仪器等）检测质控血清 20-30 次，测得结 果计算，求出该组数据的均值和标准差（SD ）表示该实验室的最佳工作质量。现举例说明 HBsAg ELISA 法检测时 OCV 的测定。使用的质控制血清为临界血清，HBsAg 浓度为 5ng/ml。在该实验室中选择 素质最好、操作 最熟练的技术员进行认真地专门测定， 选用最佳的试剂盒， 检测 之前，将恒箱、加 样器等认真校正、调校正、调试，使用新的加 样吸头等 ，即在最佳、最理想的条件下进行检测。除 质控血清外同时测 定阴性对照品和阳性对照品。并作双份测定，得出 2个吸光值（A

13、值），求 出 X。连续作 20 次，求出 20 个 X，即 X1X20。从这 20个数据中，求出 OCV 的 X 和 SD。 5.3.2 常规条件下已知值质控血清变异（routine conditions variance-known value,简称 RCVK）的测定。 做常规检验的技术人员，在常规检验的条件下，将 质控血清放在常规检测样本中，进 行 20 次检验，结果计算同 OCV 法。一般认为 RCV 的 SD 在 OCV 的 SD 两倍范围内可以接受。若太大 应该查找原因，使其向 OCV 的 SD 值靠近。在改进实验室条件后（例如较正加样器，纠正洗板操作，调正温育温度等），重新 进行R

14、CVK 的测定。如果 RCVK 的 S D 值更小，说明 OCV 不是最佳条件下测定的，应重新再测 OCV。常规条件下，RCVK 肯定要比 OCV 大。通过质控控制各项条件， 使 RCVK 的数据尽可能接近 OCV 值。RCVK 的数据反映该实验室日常工作的质量，用于作质控图，对室内检验的结果进行控制，每 日检验的结果，报告能否发出。5.3.3 常规条件下,未知值质控血清变异(routine conditions variancl-unknown value 简 称 RCVU)的测定 有时为了避免主观性,再作 RCVU 测定。测定步骤同 RCVK，但检测 的操作者不知质控血清的定 值，或在操作

15、者不知哪份是质控血汪清的条件下进行常规检验，以排除操作者的主观性。在 此不再举例说明。5.3.4 质控图 通过以上三步骤，可以开始作室内质控图，根据 RCVK 的和 SD 作质控框图。利用 质控图可以对每次 检验的结果进行监测，当没有更换另一批号试剂盒和另一批号质控血清时，该质 控 图可以连续作下去。 质控血清的 S/CO 值低于 -2SD 的范围,属告警， 应寻找原因并在质控图上记录查出的原因。ELISA 试验中，各种检验项目的误差允许范围均有待在实践中得出结论，以上只是举例说明质控方法，不是定论。 2SD 是一般公 认 的允许误差限度。每批测定放一份质控血清时，一次超 过 2SD 应作为告

16、警 ，二次超出 2SD 为失控 。当质控过程中，出现失控 时 ，出 现失控时，应查找原因，通常是试剂盒或质控血清失效造成。更换试剂盒或更 换质控血清，找出原因 纠 正后重新检验。如果 检验结 果仍达不到要求或找不到原因时，应重复进行 OCV 的检验。如果 OCV 检验的结果仍是好的，说明常规操作出 现问题。一般 认为：一 次超出 3SD；连续二次超出 2SD；3-5 次连续处于一侧的 2SD 之内；57 次连续偏向横轴的一侧，均为失控。第 、 种情况， 单独依靠记录往往是不易察 觉的，但在质控图上可以清晰地发现这种失控。 5.3.5 统计学计算方法-即刻性 质控 以上介绍的质控方法基本上与临床化学测定的质控方法相同，但 ELISA 有其特殊性，最合适的质控方法尚待研究建立。有些 实验 室不是每天进行 ELISA项目的检验，而 ELSIA 试剂盒效期短 ，用一批号 试剂 盒连