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1、碱性磷酸酶的提取分离和比活力的测定项目名称碱性磷酸酶的提取分离和比活力的测定实验目的1. 了解酶提取纯化的基本实验技术;2. 掌握碱性磷酸酶酶活力及比活力的测定方法实验材料新鲜兔肝或兔肾主要仪器设备匀浆器,冷冻离心机,分光光度计,电子天平等.实验原理碱性磷酸酶（简称 AKP）在磷酸盐代谢中起重要作用。核酸序列分析、DNA 重组技术、酶标免疫检测技术以及临床检验中都需要利用此酶。本实验取材于兔肝，经匀浆、正丁醇抽提、硫酸胺分段盐析或者有机溶剂沉淀，获得碱性磷酸酶制品。本实验采用对硝基苯磷酸二钠（p-NPP）为底物的方法测定酶活。对硝基苯磷酸二钠在碱性磷酸酶的作用下被水解为游离磷酸及对硝基苯酚，对
2、硝基苯酚在强碱性条件下显示亮黄色，在 405nm 处有强烈的吸收峰。因此可以测定 405nm 处的吸收值 A405nm 来计算产物的生成量，从而计算出酶活力，然后通过各级纯化步骤产物蛋白含量的测定,从而计算出酶的比活力.第一部分: 碱性磷酸酶的提取以下操作均在 4进行。方案一:1. 称取新鲜兔肝 2g，剪碎后，置于玻璃匀浆器中，按 1:2（m/v）加入预冷的0.05mol/LTris-HCl（pH9.0）缓冲液，匀浆后 4抽提 20 min；4，8000r/min 离心10min；取上清；此为 A 液。另取 1 支试管编号为 A，取 0.1mLA 液，加 1.9mLTris 缓冲液(pH 8.
3、8)，混匀，供测酶活性用。2.上清液中加入 1/5 体积预冷正丁醇脱脂 20min；8000r/min 离心 10min，取上清；此为 B液。吸取 0.1m1B 液，置于编号为 B 的试管中，加入 1.9m1Tris 缓冲液(pH 8.8) ，供测酶活用。3.加入硫酸铵至 35%饱和度； 430 min；8000r/min 离心 10min，弃沉淀；取上清；此为 C 液。吸取 C 液 0.2m1 置于编号为 c 的试管中，加入 1.8m1Tris 缓冲液(PH 8.8)，供测酶活性用4.然后在上清液中加入硫酸铵至 75%饱和度，4静置 30 min 后 8000r/min 离心 10min，得
4、沉淀.用 0.05mol/LTris-HCl（pH9.0 ）缓冲液溶解沉淀；此为 D 液。吸取 02m1D 液置于编号为 D 的试管中，加入 18m1Tris 缓冲液(pH8.8)，供测酶活性用方案二:1. 称取新鲜兔肝 2g，剪碎后，置于玻璃匀浆器中，以下按每克组织加入 3.0mL001mol/L 醋酸镁一 0.01mol/L 醋酸钠溶液，充分匀浆后，记录其体积 .此为 A 液。另取 1 支试管，编号为 A，取 0.1mLA 液，加 1.9mLTris 缓冲液(pH 8.8)，混匀，供测酶活性用。2. 加 1.0mL 正丁醇溶液于匀浆液中，用玻璃棒充分搅拌 2min 左右。然后在室内放置 2
5、0 min 后，滤纸过滤，滤液置离心管中。此为 B 掖。吸取 0.1m1B 液，置于编号为 B 的试管中，加入 1.9m1Tris 缓冲掖(pH 8.8)，供测酶活用。 3. 于滤液中加人等体积冷丙酮，立即混匀后离心 5min(3000 r/min)，弃上清液，向沉淀中加入 2.0mL05mol/L 醋酸镁溶液，用玻璃棒充分搅拌使其溶解，同时记录悬液体积，此为 C 液。吸取 C 液 0.2m1 置于编号为 c 的试管中，加入 1.8m1Tris 缓冲液(PH 8.8)，供测酶活性用。4.量取悬液体积，并计算使乙醇终浓度为 30需要加人的 95冷乙醇量。按计算量加入乙醇，混匀，立即离心 5min
6、(3000r/min)，量取上清液体积。倒人另一离心管中，弃去沉淀。向上清液中加入 95冷乙醇，使乙醇终浓度达 60(计算方法同前) ，混匀后立即离心5min(3500r/min)，弃上清。向沉淀中加入 20m1 0.0lmol/L 醋酸镁一 0.01mol/L 酸酸钠溶液，充分搅拌，使其溶解。5.重复操作步骤 4 后，沉淀用 3mL0.5mol/L 醋酸镁溶液充分溶解， 6.向上述剩余悬液中逐滴加入冷丙酮，使丙酮终浓度达 33，混匀后离心 5min(2000r/min)，弃去沉淀。量取上清液体积后转移至另一离心管中，再缓缓加人冷丙酮，使丙酮终浓度达50，混匀后立即离心15min(4000r/
7、min)，弃上清液，沉淀为部分纯化的碱性磷酸酶。向此沉淀中加入 2.0m1Tris pH8.8 缓冲液，使沉淀溶解，再离心 5min(2000r/min)，将上清液倒入试管中，记录体积、弃去沉淀。上清液即为部分纯化的酚液，此为 D 液。吸取 02m1D 液置于编号为 D 的试管中，加入 08m1Tris 缓冲液(pH8.8)，供测酶活性用第二部分: 碱性磷酸酶酶活力蛋白含量的测定1. 各级纯化步骤产物碱性磷酸酶酶活力的测定实验原理本实验采用人工合成的对硝基苯磷酸二钠（p-NPP）为底物的方法测定酶活。对硝基苯磷酸二钠是无色或稍带黄色的结晶固体，在碱性磷酸酶的作用下被水解为游离磷酸及对硝基苯酚，
8、对硝基苯酚在强碱性条件下呈醌式结构而显示亮黄色，在 405nm 处有强烈的吸收峰。因此可以测定 405nm 处的吸收值 A405nm 来计算产物的生成量，从而计算出酶活。试剂与仪器NaOH、20mmol/L 对硝基苯磷酸二钠（新鲜配制） 、0.1mol/LNa2CO3-NaHCO3(pH9.7)缓冲液（分别称取无水碳酸钠 10.6g 和 NaHCO3 8.4g，用800ml 去离子水溶解后，用 6mol/L 的 NaOH 调节 pH 至 9.7，然后转入 1L 的容量瓶中定容）恒温水浴锅、试管、试管架、分光光度计、秒表实验步骤取 0.1ml 20mol/L 对硝基苯磷酸二钠，1.8ml 0.1
9、mol/L Na2CO3- NaHCO3 (pH 9.7)缓冲液，于试管中混合。混匀后于 37下预热 5 到 10 分钟，再加入 100l 酶液（可以根据酶活力大小稀释或浓缩） ，立即混匀并计时，37下反应 10min。反应完成后立即加入 1ml 0.5mol/L 的 NaOH 停止酶促反应，然后于 405nm 处测吸收值。空白对照管先加入 NaOH 后再加入 100l 酶液。结果与计算以对硝基苯磷酸二钠为底物，根据水解磷酯键所产生的对硝基苯酚的量测定酶活力。酶活力单位定义为：37、pH9.7 条件下每分钟催化产生 1mol/L 对硝基苯酚的酶量为一个酶单位。按下式计算碱性磷酸酶的活性（U/m
10、L） ，已知对硝基苯酚的摩尔消光系数为 18.8103 L/(molcm） 。酶活性=A405/(18.8103反应时间)103测定液体积 /酶液体积稀释倍数2. 各级纯化步骤产物蛋白含量的测定参照 Folin-酚法测定蛋白含量的标准曲线,测定各级纯化步骤产物蛋白含量取 2 支试管，分别加入 0.2 毫升样品(待测酶液) 和 0.2 毫升蒸馏水，再分别加入 0.8 毫升蒸馏水使样品体积达到 1 毫升。加入 Folin-酚试剂甲（ml）摇匀，室温下放置 10 分钟;再加入 Folin-酚试剂乙（ ml）,摇匀，在 30保温（或室温下放置）30 分钟,在 500nm 测定吸收值.将样品的光吸收值在
11、标准曲线上查出相应的标准蛋白溶液的浓度。然后乘以稀释倍数，得出未稀释样品含蛋白质的克数。第三部分: 碱性磷酸酶比活力的测定各级纯化步骤产物碱性磷酸酶比活力的计算,绘制制备碱性磷酸酶的表格分离阶段 A 液 B 液 C 液 D 液总体积/ml蛋白质浓度/(mg/ml)总蛋白质/mg每毫升活力单位/U总活力单位/U比活力/(U/mg)纯化倍数得率%实验预期结果1.了解酶提取纯化的基本实验技术并得到初步纯化的碱性磷酸酶酶酶液.2.掌握碱性磷酸酶酶活力及比活力的测定方法项目创新点1从新鲜材料中制备碱性磷酸酶,通过测定酶活力及蛋白含量计算出酶的比活力,学生可以学会酶的制备的基本实验技术,并得到逐级纯化的碱性磷酸酶酶液.学会计算酶比活力,通过比较其酶活力的逐渐减少和比活力的逐渐增高来了解各纯化步骤的合理性.2 本实验采用对硝基苯磷酸二钠（p-NPP）为底物的方法测定酶活，该方法是 IFCC(国际临床化学和实验室医学联盟)和我国检验学会的推荐的较新的方法。实验学时数5
