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1、1脊神经根性撕脱伤所致脊髓运动神经元中 Eta作者：傅永慧，沈涛，付勤，吕刚，王海义【关键词】 脊神经根/损伤Alteration of Eta1 expression in spinal motoneuron resulting from spinal root avulsion【Abstract】 AIM: To explore the alteration of Eta1 expression in motoneurons following spinal root avulsion and its significance. METHODS: Animal model of spina
2、l root avulsion was established and immunohistochemistry and in situ hybridization were employed to investigate whether spinal root avulsion will alter the levels of Eta1 expression in the spinal motoneurons. RESULTS: A low level of Eta1 was found in a subset of spinal motoneurons before avulsion bu
3、t 3 d after avulsion, the number of Eta1expressing motoneurons increased by 52.5%, though the total number of motoneurons reduced by 31.6%. CONCLUSION: Eta1 is unregulated in spinal motoneurons after spinal root avulsion and it may have some protective effect on motoneurons.2【Keywords】 Eta1; spinal
4、cord; spinal nerve roots/injuries【摘要】 目的： 探讨脊神经根性撕脱伤后脊髓运动神经元中 Eta1 mRNA 表达的意义. 方法： 首先建立脊神经根性撕脱伤的动物模型，采用原位杂交和免疫组织化学方法检测损伤前后 Eta1 mRNA 在脊髓运动神经元中表达的变化. 结果： 损伤前 Eta1 在脊髓运动神经元中微量表达. 损伤后 3 d，损伤侧脊髓运动神经元总数减少 31.6%，但表达 Eta1 的运动神经元数量增加 52.5%. 结论： 脊神经根撕脱后 Eta1 在脊髓运动神经元内上调表达可能是对神经元本身的一种保护.【关键词】 Eta1；脊髓；脊神经根/损伤0
5、 引言Eta1 是一种磷酸化糖蛋白1 ，在中枢神经系统的炎症2,3及创伤愈合过程中起到一定作用 . 然而，关于脊神经根性撕脱伤后 Eta1 mRNA 在脊髓运动神经元中表达的变化及意义尚无相关报道. 我们建立脊神经根撕脱的动物模型，研究脊神经根撕脱是否可以改变 Eta1 在大鼠脊髓运动神经元中的表达水平.31 材料和方法1.1 材料雄性 Wistar 鼠 8 wk 龄，体质量 200 g，30 只. 用 14 g/L氟烷及 1.5 L/min O2 对动物行吸入麻醉，于髂嵴上方作左旁正中切口，长约 2.5 cm. 沿中线剥离左侧最长肌，并用小剪刀剪除 L5横突. 将经过 L5 横突的 L3,
6、L4 神经根与周围组织分开，用小钩将其轻轻提起，并用小血管钳将其从椎间孔拉出，逐层关闭切口，制成L3, L4 神经根的椎管外撕脱模型. 术后 1， 3， 7， 14 或 21 d 处死动物. 如文献4 所述方法，在戊巴比妥麻醉下，通过灌注泵用冷生理盐水及 40 g/L 的低温多聚甲醛（溶于 pH7.4 的 PBS 中）对实验鼠进行心内灌注. 收集含有 L3，L4 脊髓的组织块，于固定液中4过夜固定，然后低温保护于含 200g/L 蔗糖的 PBS 溶液中过夜. 用恒温切片机(Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)切取 12 m 的切片并放置于多聚赖氨酸包埋的载
7、玻片上. 1.2 方法 Nissl 染色，利用甲酚紫对切片进行染色 . 原位杂交，依文献5所述进行体外转录 . 用 BamHI 或 XbaI 切割含有鼠 ETA1 cDNA 序列（核苷酸从 259 到 1025）的 pCR质粒(Invitrogen)，使之线性化. 按照操作说明书，利用 digoxigeninRNA 标记物（Roche）及 SP6, T7 的 RNA 聚合酶（Takara） ，从线性化的质粒4中进行正义、反义 RNA 探针的体外转录. 用文献6所述方法的改良法进行原位杂交. 以正义探针杂交组作为阴性对照. 原位杂交反应后，PBS 清洗切片 5 min，然后与一抗在 4下反应过夜
8、. 一抗为单克隆小鼠抗 NeuN 抗体(1400). 切片用 PBS 冲洗 3 次以上，每次 10 min. 最后与 Alexa 荧光 488 共轭的羊抗小鼠 IgG 抗体反应并用荧光固定剂(Dako Cytomation, Copenhagen)固定于载玻片上. 如文献5所述进行免疫组化反应. 一抗是鼠抗神经细胞核抗体(NeuN; 1400; Chemicon International, Temecula, Calif) . 随机从切片中同侧及对侧的脊髓前角选取 0.147 mm2 大小的范围，计数 NeuN 和 Eta1 阳性细胞. 统计学处理： 采用方差分析评估组间差异，并用 LSD
9、法进行均数间的多重比较. P0.05 为有显著意义 . 2 结果脊神经根撕脱伤可造成脊髓运动神经元的逐渐减少（Fig 1A, B）. 从伤后 3 d 起，损伤侧前角运动神经元数目开始明显减少，而同期对侧前角运动神经元的减少则不明显. 运动神经元的减少随时间显著增加，在伤后 21 d 时，伤侧已有 50%以上的运动神经元降解，伤侧运动神经元的数量为对侧的 45%（Fig 2）. 此时对侧运动神经元的减少与对照组比较也有显著差异（P0.05）. 在正常对5照组运动神经元细胞内观察到 Eta1 mRNA 的微弱表达（Fig 3A）. 损伤后 3 d，在伤侧运动神经元细胞中的杂交信号水平升高（Fig
10、3B）. 在 21 d 时，Eta1 mRNA 的表达恢复到正常水平 . NeuN 的荧光免疫组化及 Eta1 的原位杂交（Fig 4A，B）两种方法证实 Eta1在运动神经元细胞的表达. 伤后 3 d，比较损伤侧及对侧的前角运动神经元（NeuN 阳性）表达 Eta1 的细胞数量，虽然伤侧 NeuN 阳性的神经元细胞数量减少 31.6%，但表达 Eta1 的细胞数量增加了52.5%（Fig 5）.3 讨论本实验提示，脊神经根撕脱后，Eta1 在脊髓运动神经元中的表达上调. 虽然由于神经元的死亡，脊髓前角中 NeuN 阳性的神经元减少，但 Eta1 阳性的神经元细胞数量是增加的. 这表明撕脱伤引
11、起运动神经元细胞中 Eta1 表达的上调，以此对运动神经元起保护作用. Chabas 等7 报道，在实验性自身免疫脑脊髓炎的急性期和复发期，Eta1 在脑和脊髓的小神经胶质细胞及神经元细胞中均有表达，而在缓解期无表达. 因为脊神经根撕脱伤模型也可被视为中枢神经系统8炎性反应的模型，所以这两个独立实验的相似结果，进一步证明 Eta1 在神经元细胞中可能存在保护作用. 另外，在其他一些实验中发现的结果，如 Eta1 可以保护肿瘤细胞9 ，还能促进培养细胞的发育，防止培养的皮质神经元缺氧死亡10也支持这一论点.6综上所述，在脊神经根撕脱伤后的运动神经元中可观察到Eta1 表达的上调. 我们认为 Et
12、a1 在中枢神经系统中可能存在着不同于促进炎症反应的其他功能，即保护神经元细胞抵御 iNOS 介导的降解的功能. 致谢： 大阪大学 Dr. Shintaro Nomura 提供含有Eta1 cDNA 序列的质粒 . 【参考文献】1 唐红卫，潘阳林，聂勇战，等. Osteopontin 特异性siRNA 真核表达载体的构建及其在 GC9811 胃癌细胞中沉默效应的鉴定J. 第四军医大学学报，2004;26（3）:202-205.Tang HW, Pan YL, Nie YZ, et al. Construction of eukaryotic expression vector of siRNA
13、 specific for osteopontin and characterization of its efficiency in GC9811 gastric carcinoma cell line J . J Fourth Mil Med Univ, 2004;26（ 3）:202-205.2 Kim MD, Cho HJ, Shin T. Expression of osteopontin and its ligand, CD44, in the spinal cords of Lewis rats with experimental autoimmune encephalomyel
14、itis J. 7J Neuroimmunol, 2004;151(12):78-84.3 Moon C, Shin T. Increased expression of osteopontin in the spinal cords of Lewis rats with experimental autoimmune neuritis J. J Vet Sci, 2004; 5(4):289-293.4 陶发胜，李辉，李云庆，等. 大鼠脊髓前角神经元内维生素 D 依赖性钙结合蛋白与小白蛋白共存J. 第四军医大学学报，2004;25 （18 ）:1645-1647.Tao FS, Li H,
15、Li YQ, et al. Coexisfence of calbindin D28k with parvalbumin in neurons of spinal cord anterior born in rats J . J Fourth Mil Med Univ, 2004;25（18）:1645-1647.5 Hashimoto M, Koda M, Ino H, et al. Upregulation of osteopontin expression in rat spinal cord microglia after traumatic injury J. J Neurotrau
16、ma, 2003;20:287-296.6 Ikeda O, Murakami M, Ino H, et al. Acute upregulation of brainderived neurotrophic factor expression resulting from experimentally induced injury in the rat spinal 8cord J. Acta Neuropathol, 2001;102:239-245.7 Chabas D, Baranzini SE, Mitchell D, et al. The influence of the proinflammatory cytokine, osteopontin, on autoimmune demyelinating disease J. Science, 2001;294:1
