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1、1柔嫩艾美耳球虫 TA4 抗原基因 cDNA 在乳酸乳球菌中的克隆与表达张雪莉 1，荣泽秦 2，金崔尚 3，何 庆 2，刘 尚 2（1.北京市农林科学院 畜牧兽医研究所，北京 100089；2.中国农业大学 动物医学院，北京 100094；3.中国农业科学院 哈尔滨兽医研究所，黑龙江 哈尔滨 150001)摘要：用 PCR 技术特异扩增了柔嫩艾美耳球虫 TA4 抗原基因 cDNA 序列，克隆至质粒 pMD18-T 中，获得重组质粒 pMD18-T-TA4，采用 Kpn I/Sa cI 双酶切法及 PCR 确认正确后，将 TA4 基因 cDNA 目的片段亚克隆到乳酸乳球菌表达载体 pMG36n
2、中，电穿孔法转化乳酸乳球菌 LM0230，获得重组质粒 pMG36n-TA4，采用 Kpn I/Sac I 双酶切法及 DNA 测序证明 cDNA 序列完全正确。 获得 TA4 乳酸乳球菌表达株，经 SDS-PAGE 电泳分析，结果表明表达产物与预期大小的 TA4 蛋白分子量一致。关键词：柔嫩艾美耳球虫；TA4 抗原基因 cDNA；乳酸乳球菌；克隆与表达Cloning and expression of TA4 antigen from Eimeria tenella in Lactococcus lactis ZHANG Li1, QIN Ze-rong2, CUI Shang-jin3,
3、HE Zhao-qing2, LIU Shang-gao2(1. Beijing Municipal Academy of Agriculture 2. China Agricultural University, Beijing 100094, China; 3. Harbin Veterinary Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Harbin 100051, China)Abstract: TA4 antigen cDNA of E.tenella was amplified by PCR an
4、d cloned into a vector pMD18-T. The positive plasmid contained TA4 antigen cDNA was determinded by restriction enzyme analysis and PCR. The plasmid pMD18-T-TA4 and the vector pMG36n were both digested by Sac I and Kpn I. The cDNA encoding TA4 antigen was subcloned into pMG36n and transferred into La
5、ctococcus lactisLM0230 by electroporation. It proved that the positive recombinant plasmid pMG36n-TA4 contained cDNA encoding TA4 antigen by restriction enzyme analysis and sequence determination. In the positive transformants, the TA4 antigen was expressed as a fusion protein in Lactococcus lactis
6、LM0230, which was verified by SDS-PAGE .Key words: Eimeria tenella ; TA4 Antigen; Lactococcus lactis; cloning and expression 球虫子孢子表面的一种抗原 TA4 为 25 Ku 的糖蛋白，是由 8 Ku 和 17 Ku 两条多肽通过二硫键连接而成的。在孢子化开始后 1624合成 1。 Files2等利用一段标记的寡聚核苷酸序列作探针，首先从基因文库中筛选出了 TA4 抗原的基因（ta4） ，其后 Brothers3利用 ta4基因片段克隆出了该基因的全长 cDNA，并将此在
7、大肠杆菌中直接表达或作为 -半乳糖苷酶基因融合蛋白的一部分表达。近年来乳酸菌分子生物学进展迅速，探索一些有价值的基因在乳酸菌中克隆和表达已成为乳酸菌分子遗传学研究的热点 46。因此，乳酸菌基因工程菌在功能食品、医疗保健及微生态制剂、人工口服疫苗等领域的应用均具有诱人的前景 5。本研究主要采用分子克隆技术，进行 TA4 抗原 cDNA 在乳球菌中克隆和表达的基础性工作，构建TA4 抗原的 cDNA 重组表达质粒，并用电穿孔法导入乳球菌中，筛选到能表达 TA4 的工程乳酸菌，将外源基因表达产物与有益菌集为一体，为球虫基因疫苗发展的新途径奠定基础。收稿日期：2005-04-13基金项目：本课题为国家
8、自然科学基金资助项目（30070571）作者简介：张雪莉（1973-） ，女，汉族，新疆乌鲁木齐人，博士，助理研究员，主要从事畜禽传染病的分子防制.21 材料和方法1.1 菌株和质粒 乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）LM0230、大肠杆菌（E.coli）JM109 由本室保存。pMD18-T vector 购于 TaKaRa 生物工程公司。pMG36n 本室构建。大肠杆菌的液体或固体培养用 LB 培养基，乳酸乳球菌培养用 GM17 培养基，乳酸乳球菌电穿孔转化子用SGM17MC 培养基。培养基配制及培养条件 等参见文献7。1.2 PCR 引物 用于 TA4 抗原基因 cDNA
9、 PCR 扩增的引物：5端引物（P1）：5-CCGAGCTCATTCAGGATTACCCAACAG-33端引物（P2）：5-CCGGTACCACTCAAGCATTTCACTCAG 3用于 TA4 抗原基因 cDNA 测序的引物：5端引物（P3）：5-CCTCGGGATATGATAAGATT 33端引物（P4）：5-TTTCTCAGTTCAACGACACA 3 1.3 工具酶和化学试剂 Sac I、Kpn I、T4 DNA ligase 购自 TaKaRa 生物工程公司。PCR Master 系统为 TaKaRa 公司产品。其它试剂均为国产分析纯或试剂纯。1.4 TA4 抗原基因 cDNA PC
10、R 扩增 PCR 扩增引物按已发表的序列设计，以 P1 为 5引物，P2 为 3引物，用含 TA4 的质粒为模板。反应条件：94 C 预变性 3 min，94 C 变性 1 min，58 C 退火 1 min，72C 延伸 50s，反应进行 30 个循环，72 C 延伸 7 min。1.5 TA4 抗原基因 DNA PCR 产物的连接转化 由于 PCR 产物的 3端多了一个不依赖于模板组成的脱氧核苷酸 A，所以利用 T-A 互补原理将 PCR 产物与 pMD18-T Vector 连接，插入片段与载体在一定的浓度下，比值在 1:33:1 之间即可取得良好结果。将 PCR 产物纯化后按试剂盒说明
11、书进行连接。再将连接产物转化大肠杆菌 JM109。1.6 重组质粒的筛选与鉴定（宿主 E.coli）（1）挑转化子若干个，在 3ml LB 液体培养基中培养 12 h -16 h，质粒小抽提后经 1 %凝胶电泳，根据 DNA 分子量的大小，初步筛选阳性质粒；（ 2）取初步筛选的阳性质粒进行Sac I 和 Kpn I 酶切，1 %的琼脂糖凝胶电泳分析，进一步筛选阳性质粒；（3）将重组质粒进行 PCR 反应，比较 PCR 产物与酶切产物的大小。1.7 TA4 在乳酸乳球菌中的克隆 （1）将表达载体 pMG36n 和含 TA4 基因目的片段的质粒用限制性内切酶 Sac I 和 Kpn I 进行酶切。
12、 （2）利用 DNA 快速纯化回收试剂盒将酶切后的TA4 基因目的片段及载体片段回收，目的基因片段及载体片段按 3:1 混合，用 T4 DNA 连接酶在 14 C16 C 连接过夜。 （3）取 2L 连接产物用电穿孔法转化乳酸乳球菌 LM0230，脉冲参数为 1.25 KV/cm，25 F 和 200 。恢复培养基用 SGM17MC。1.8 重组表达质粒的筛选与鉴定 （宿主 L.L.0230） 对初步筛选的阳性菌进行质粒抽提 8，Sac I 和 Kpn I 酶切分析，PCR 和测序鉴定。1. 9 6 TA4 抗原基因的表达 将鉴定为阳性的重组质粒载体在乳酸菌中表达，接种于 MG17中，30 C
13、 培养过夜，收集菌体，加等量上样缓冲液 100 C 作用 10 min，离心后取上清用于SDS-PAGE 电泳。2 结 果2.1 TA4 抗原基因 cDNA PCR 扩增 根据已知的 TA4 基因序列，设计了 PCR 扩增引物 P1和 P2，进行 PCR 扩增。结果表明扩增的片段大小与预期相符（预期为 788 bp） ，见图 1。2.2 pMD18-T-TA4 重组质粒的鉴定 将 TA4 的 PCR 产物通过 T-A 方式与 pMD18-T 载体进行连接，转化大肠杆菌 JM109。通过蓝白斑筛选，对初筛到的阳性克隆子用碱裂解法进行质粒小抽提。用 Sac I 和 Kpn I 进行酶切，产物经 1
14、 %的琼脂糖凝胶电泳分析，重组质粒显示两条带，一条大小与 750 bp 相近，一条与 pMD18-T 质粒大小相近（箭头所示） ，结果见图 2。3由此得到含有目的片段的重组质粒，命名为 pMD18-T-TA4。1. DL 2000 Marker； 2.空白对照；3. TA4 PCR 产物lane1：DL 2000 Marker； lane2：Control；lane3： TA4图 1 TA4 基因 cDNA PCR 产物Fig.1 PCR product of TA4 cDNA1: DL2000 marker; 2：pMG36n-TA4 Sac I and Kpn I 酶切产物 3: pMD1
15、8-T-TA4 Sac I and Kpn I 酶切产物; 4: DNA Hind marker1: DL2000 marker; 2：pMG36n-TA4 disgested with Sac I and Kpn I；3: pMD18-T-TA4 disgested with Sac I and Kpn I; 4:DNA Hind marker图 2 重组质粒的酶切产物Fig.2 Agarose gel electrophoresis of recombinant plasmid digested with restriction enzyme2.3 重组表达质粒 pMG36n-TA4 的鉴
16、定 经初筛后得到阳性克隆子用乳酸乳球菌质粒提取法进行质粒抽提。再将重组表达质粒 pMG36n-TA4 用限制性内切酶 Sac I 和 Kpn I 进行酶切，37 C 过夜，得到预期的目的片段，电泳分析，重组质粒显示两条带，一条大小与 750 bp 相近，一条与 pMG36n 质粒大小相近，结果见图 2，由此得到含有目的片段的重组质粒，命名为 pMG36n-TA4。以纯化的 pMG36n-TA4 重组质粒为模板，用设计的特异引物进行序列测定，结果表明插入的片段与预期设计完全相吻合，阅读框架正确，从而进一步确定了表达重组质粒构建的正确(图 3)。GAGCTCATTCAGGATTACCCAACAGCAGTTACGCTGGACTGTAAAGAGGC 50GATGAACAAGCTGAGAAAAGCAGCAGGACTTCCTGCATTCGAAGATGCTG 100TGGGAGACACA
