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1、人类血小板同种抗原研究进展【摘要】 人类血小板同种抗原（human platelet alloantigens, HPA）是由血小板糖蛋白携带的一类特异性抗原，其基因具有单核苷酸多态性（SNP）。HPA 可介导同种抗体的产生，引起同种免疫反应，与输血后血小板减少性紫癜（PTP）、血小板输注无效（PTR ），新生儿同种免疫血小板减少性紫癜（NAITP）及移植排斥密切相关。因其在临床输血实践及相关疾病中的重要作用，而备受关注。本文就 HPA 抗原的命名、血小板糖蛋白多态性、HPA 检测方法、血小板同种免疫反应机制以及相关疾病研究进展作一综述。 【关键词】 HPA; 血小板糖蛋白复合物多态性; 检测
2、方法Advances in the Studies on Human Platelet Alloantigen ReviewAbstractHuman platelet alloantigens (HPA) are specific antigens carried by platelet glycoproteins, which genes showing single nucleotide polymorphism. HPA can induce alloantibodies bringing about alloimmune response. They play important r
3、oles in post-transfusion refractoriness to platelets, post-transfusion thrombocytopenic purpura, fetomaternal alloimmune thrombocytopenia, and graft-versus-host disease. Because of their side effects in clinical blood-transfusion, there were a great deal of studies on HPA during last few decades. Th
4、is review focuses on the nomenclature of HPA, the polymorphisms of platelet glycoproteins, HPA typing of the serological and molecular technology, as well as the mechanism of alloimmunization to HPA and correlated diseases.Key wordsHPA; platelet glycoproteins polymorphisms; detection method人类血小板同种抗原
5、（human platelet alloantigen, HPA）是分布在血小板糖蛋白上一类特异性抗原，又称血小板特异性抗原。在目前已检测出的 24 个 HPA 抗原中,除 HPA-14bw 基因是因核苷酸 1909 到 1911 位置上 AAG 3 个碱基缺失产生外,其他的 HPA 基因均具有单核苷酸多态性(SNP)1 。HPA 可介导同种抗体的产生，引起同种免疫反应，引发同种免疫性血小板减少，如输血后血小板减少性紫癜（PTP）、血小板输注无效（PTR）及新生儿同种免疫血小板减少性紫癜（NAITP），同时在临床移植中，还会引起移植排斥等相关的疾病。准确检测和鉴定 HPA，对于临床医学和输血实
6、践具有重要意义。血小板抗原血小板表面具有复杂的血型抗原，如 ABO 和一些多糖抗原，在输血中起重要作用。通常血小板抗原可分为两大类：一类是血小板相关抗原，与其他细胞表面或组织共有的抗原，主要与红细胞的 ABO 血型系统以及 HLA 有关；另一类是血小板特异性抗原，由血小板特有的抗原决定簇组成，表现血小板独特的遗传多态性，只在血小板和巨核细胞上表达。先前被看作是“血小板特异性”的血小板同种抗原也存在于其他细胞或组织上2。血小板特异性抗原人类血小板同种抗原（HPA）是通过相应抗体的检出而发现的，它具有独特的型特异性，血小板特异性抗原都分布在血小板糖蛋白上，构成血小板膜结构中的一部分3。血小板特异性
7、抗原属于双等位共显性遗传系统，HPA 多态性分布存在种族差异4。命名法则1959 年，Van Loghem 等 3在多次输血的妇女血清中，发现 Zwa，这是第一个被鉴定的人类血小板抗原。随后，人类血小板抗原的研究开始。20 世纪 60 年代到 90 年代，Ko, Bak,Yuk,Gov,Mo,Max 相继被发现。1990 年，为避免新旧血小板抗原名称的混淆，国际血液学标准化委员会、国际输血协会（ISBT）血小板血清学研讨会决定，在系统前冠以HPA，即表示人类血小板特异性抗原。2003 年，由国际输血协会( ISBT) 和国际血栓和止血协会( ISTH) 联合成立的血小板命名委员会 (PNC)
8、,对 HPA 进行了系统命名,建立了命名原则和认可新抗原的标准。至今，使用血清学方法已检出 24 个血小板抗原，其中 Vaa 和Moua 抗原尚未达到国际命名要求,其余 22 个抗原已被 PNC 正式命名（见附表）。HPA 命名原则是以 HPA 加数字表示。在共显性双等位基因的遗传系统中, a 表示基因频率大于 50 %的等位基因, b 表示基因频率小于 50 %的另一等位基因。若其中一个等位基因尚未被发现,则在数字后加 w 5。目前已知的系统有 6 对： HPA-1-HPA-5，HPA-15 。24 个抗原主要分布在糖蛋白 GPb，GP a，GPb，GP a 以及 CD109 上，具体分布情
9、况及其单核苷酸多态性见附表。血小板糖蛋白复合物及其多态性糖蛋白 GPb/a 复合物多态性GPa（CD61， 3）是 1 个 90 kD 的单链蛋白，由 3 个结构域组成： 由 28 个二硫键高度交叉连接的细胞外区域；跨膜结构域；短的细胞质化的片段。GPb（CD41， b）是跨膜蛋白，细胞外 116 kD 的重链，通过二硫键与 22 kD 的轻链共价结合。GPb/a 复合物是由 和 非共价结合组成的异二聚体整连蛋白 (见图)。GPb 和 GPa 糖蛋白分别由位于第 17 号染色体长臂上的 ITGA2B 和 ITGB3 基因所编码。GPb 上携带 HPA-3 和 HPA-9bw； GPa 携带 9
10、 种 HPA 抗原，分别为 HPA-1，HPA-4，HPA-6bw，HPA-7bw，HPA-8bw，HPA-10bw，HPA-11bw，HPA-14bw ，HPA-16bw 6(见附图)。 Table . Human platelet alloantigens（略）糖蛋白 GPb/V/复合物多态性糖蛋白 GPb/V/复合物 (CD42, von-Willerbrand 因子受体 )有 4 个跨膜组分： GPb（CD42b， 143 kD）与 GPb（CD42c， 22 kD ）由 1 个二硫键共价连接；GP（CD42a， 20 kD）和 GPV（CD42d， 83 kD）非共价结合。以上 4
11、种糖蛋白都是富含亮氨酸重复序列的蛋白家族成员。编码 GPb 的基因 GP1BA 位于第 17 号染色体上，编码 GPb 的基因 GP1BB 位于第 22 号染色体上；编码 GPV 和 GP的基因均位于第 3号染色体上。GPb 携带 HPA-2(见附图)；GPb 携带 HPA-12bw；GPV 和 GP无多态性6。糖蛋白 GPa- a 复合物多态性GPa 是一条 165 kD 的 2 链，GPa 是一条 145 kD 的 1 链(见附图) 。GPa，又称 PECAM-1，糖蛋白 GPa- a （CD49/CD29 ，21）复合物也存在于活化的 T 淋巴细胞和几类其他类型的细胞中。 和 链与胶原蛋
12、白的结合依赖 Mg2+。GPa/a 中，只有GPa 有多态性，编码的 GPa 基因 ITGA2 位于第 5 号染色体上，GPa 携带 HPA-5 和HPA-13bw 6(见附图)。CD109 糖蛋白CD109 糖蛋白位于活化的血小板和 T 细胞上，编码基因位于第 6 号染色体上。CD109糖蛋白是与糖基磷脂酰肌醇（GPI）连接的单聚体，约 170 kD，是 2 巨球蛋白/C3，C4，C5 含硫代酯蛋白家族的成员7，CD109 糖蛋白携带 HPA-15（Gov ），具有两个等位基因（HPA-15a，HPA-15b），HPA-15 突变遗传因子是由 A-C 单核苷酸多态性反映的，A-C 单核苷酸取
13、代发生在 CD109 cDNA 的编码区 2108 位点，使 CD109 的第 682 位氨基酸发生 Tyr/Ser 替代8 (见附图)。HPA 抗原检测方法血清学方法血小板免疫荧光试验（PIFT） 1978 年，Von-den Borne 等9发明了 PIFT。该法用待测血清孵育已知血小板，洗涤，再与荧光物标记的抗球蛋白反应后洗涤，在荧光显微镜下观察结果。该法是较为可靠的血小板定型方法,1986 年被国际血小板血清学研讨会确定为标准的参考方法。流式细胞术 ( FCM )1986 年,Rosenfeld 等10发明了此技术。该法将待测血清和荧光标记的已知型别的血小板抗体孵育后，用流式细胞仪检测
14、11。FCM 用于免疫性血小板减少症患者的血小板相关抗体及血小板膜糖蛋白检测,具有灵敏、快速、简便的特点,是适用于临床诊断的新方法12。单克隆抗体免疫固定血小板抗原方法（MAIPA） 1987 年，Kiefel 等13建立了单克隆抗体免疫固定血小板抗原方法，是目前使用最为广泛的方法。该法先制备羊抗鼠 IgG包被的多孔板，另外，将鼠抗人血小板糖蛋白单克隆抗体和带有抗体的血小板共同孵育，再将孵育后的复合物加入多孔板，孵育，洗涤，最后加入酶联羊抗人抗体和酶反应底物后显色，定量测定血小板抗体。此方法敏感度高、特异性强，即使是血小板上抗原数量很少的 HPA-5 抗原，也能检测出。MAIPA 方法可灵敏地
15、检测血小板特异性抗体。简易致敏红细胞血小板血清学试验（SEPSA） 1993 年，由刘达庄等14发明。该法以抗人 IgG 抗体致敏红细胞为指示细胞，直接指示固相血小板抗原抗体免疫反应，检测血小板抗体11。若血小板上存在抗体，则指示细胞呈扩散分布，为阳性；若无抗体，则指示细胞聚集在底部，呈扣状，为阴性。该方法操作简单，微量，重复性、特异性和敏感性均较理想，固相化的血小板及抗 IgG 指示细胞能长久保存备用，可开展大量样本的检测工作3。 单克隆抗体酶联免疫吸附试验该法用多聚甲醛固定抗血小板糖蛋白单克隆抗体后，加入待测血清，最后加辣根过氧化酶标记的羊抗人 IgG，用底物邻苯二胺（ O-phenyle
16、ne diamine OPD）显色11。 放射免疫沉淀放射免疫沉淀使用放射性同位素标记的血小板膜蛋白，与受检血清结合，电泳分离后采用自身显影原理检测是否存在血小板抗体1。基因分型方法聚合酶链式反应序列特异引物分型技术（PCR-SSP） 1993 年,Metcalfe 等15首次运用序列特异性引物 PCR 成功地对 HPA-1 进行分型。SSP-PCR 的原理：设计特异性引物，利用引物 3端的特异性，直接扩增相应的 HPA 片段，PCR 产物凝胶电泳以后，以紫外线透射来检测，DNA 条带的存在或缺失即可确定基因型。特点： SSP-PCR 操作比较简单，耗时较少，适合小批量标本，是目前 HPA 基因定型中最常用的一种技术。实时定量 PCR（real-time quantitativ
