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1、1老年人载脂蛋白 E 基因多态性、骨密度和骨量丢失作者：周波,王晓红, 王松涛 ,郭连营,徐超, 张卓，阚志英【摘要 】 探讨老年人载脂蛋白 E（ApoE）基因多态性与髋骨密度（BMD） 、骨丢失的关系。方法:随机选取沈阳市 60 岁以上汉族健康老年人 100 名，用聚合酶链反应限制性片段长度多态性（PCRRELP ）方法检测 ApoE 基因型，用 DPX-L 双能 X 线吸收仪（Lunar,USA）分别在 2000 年和 2005 年两次测量研究对象髋部骨密度。结果：该人群 ApoE 基因型频率分布为 E2/3:17%, E3/3:66%,E3/4:15%, E4/4:1%，没有 E2/2
2、和 E4/4 型。等位基因频率分部为 2：8%， 3：84%，4：8%。无论男女携带 ApoE4基因组和不携带 ApoE4 基因组间年龄、身高和体重均无差异。在2000 年，携带 ApoE4 基因组和不携带 ApoE4 基因组两组股骨颈、大转子和 Ward 区的骨密度经身高、体重和年龄校正后，男女均没有显著性差异；相同分析各部位年骨丢失率也没有显著性差异。结论：该人群 ApoE 基因型与髋部骨密度无明显相关性。 【关键词】 载脂蛋白 E；基因多态性；骨密度；骨丢失AbstractObjective:To study the association between 2the ApoE gene
3、polymorphism and bone mineral density (BMD), bone loss in older adults.Methods:One hundred healthy Han volunteers over 60 years old in Shenyang were selected.ApoE gene was measured by polymerase chain reactionrestriction fragment length polymorphism (PCRRELP).BMD at hip was measured using dual-energ
4、y X-ray (DPXL) absorption apparatus (Lunar,USA) in 2000 and 2005, respectively.Results：The ApoE gene phenotype in the population was E2/3: 16%, E3/3: 66%, E4/3:15%, E4/4:1%, while E2/2 and E4/2 was not found. The ApoE all lelomorph frequencies were 8% for2，84% for3，8% for4. There were no difference
5、in age, height and weight with the presence ApoE4 and absence ApoE4 in women and men. In 2000， after adjustment for height, weight, and age, there was no significant difference of the BMD in the femoral neck, trverosity and Ward areas between presence Apo E 4 and absence ApoE4 women and men. Annuali
6、zed bone loss rate at hip did not differ by ApoE genotype for women and men. Conclusion:In our data, there is no significant association between Apo E genotype and BMD, bone loss of hip.Key wordsApolipoprotein E gene; polymorphism; bone 3mineral density; bone loss骨质疏松症是与多种基因相关的疾病，其侯选基因的研究对于评估骨质疏松性骨折
7、的危险性、基因诊断和治疗具有重要作用。近年来，国内外学者越来越重视载脂蛋白 E（ApoE）基因多态性与骨质疏松的关系。有研究表明 ApoE4 型基因携带者骨量丢失速度快，易导致原发性骨质疏松症及其骨折1-3。而另一些研究没有观察到ApoE 基因多态性与骨密度及骨丢失有关4-7。本文探讨了沈阳市老年人的 ApoE 基因多态性与髋部骨密度及骨量丢失的关系。 对象与方法1.1 对象2000 年 3 月在沈阳市某社区内随机选出无血缘关系 60 岁以上的汉族健康老年人作为研究对象，排除患有糖尿病、甲状腺疾病、肾脏疾病等影响骨代谢的疾病,并未服用维生素 D 和钙补充剂，严重高脂血症者也被排除。于 2005
8、 年 3 月对上述研究对象进行跟踪研究，将资料完整者纳入本文，共 100 名，其中男 46 名，年龄（66.84.7 ）岁，女 54 名，年龄（64.63.8）岁。1.2 方法41.2.1 ApoE 基因型测定取静脉血 5ml 经 EDTA 抗凝，DNA 提取试剂盒（QIAamp DNA Mini Kit ）提取 DNA。PCR 引物按参考文献设计8 。上下游引物序列分别为：5TCCAAGGAGCTGCAGGCGGCGCA3 ；5ACAGAATTCGCCCCGGCCTGGTACACTGCCA3 。PCR 反应体系为 50l，包括基因组 DNA3l，10扩增缓冲液；dNTPs 各200 mol/
9、L；引物各 25pmol。二甲基亚枫5l， MgCl22.5mmol/L, Taq DNA 聚合酶 2 U （Promega ） 。置热循环仪（Biometra,T3）中按下列程序循环 30 次，即 95变性 30s ,60退火 30s ,72 延伸 1min 30s，最后 72 再延伸10min。限制性酶切反应在 40l 体系中进行，包括 PCR 反应产物10l，Cfo I 限制性内切酶 20U（Promega） ，37 ，4 h。采用非变性聚丙烯酰胺电泳（浓度为 12%，交联度 29：1） ，在常温，离子强度为 1TBE 条件下，70V 恒压电泳 1.5h，分离 Cfo I 产物。0.5m
10、l/L 浓度的 EB 中染色 40min，在紫外灯下观察、照像，分型。基因分析在已知标准物的对照下反复进行多次，以排除错误出现。1.2.2 髋部骨密度测定用 DPXL 双能 X 线吸收仪（Lunar,USA）在 2000 年 3 月5和 2005 年 3 月分别两次测定研究对象左测股骨颈、Ward 三角和大转子区的骨密度（g/cm2） 。体模反复测定的变异系数为0.45%。1.3 统计学分析用 Data Desk 6.1 软件(Data Description Inc, Ithaca,NY)进行数据处理。基因频率采用基因计数法计算，基因频率比较采用似然比 2 检验。每位研究对象年骨丢失率=（第
11、 2 次骨密度值第1 次骨密度值）/第 1 次骨密度值5100% 。为校正部分偏态分布数据，将数据（除年龄外）均变成自然对数后再进行分析。各组内的骨密度比较采用配对 t 检验。基因型各组间骨密度均值和年骨丢失率的比较用协方差分析，因为已知身高、体重和年龄是影响骨密度的因素，在分析时均以这些因素校正。2 结果2.1 ApoE 基因型及等位基因频率分布该人群 ApoE 基因型分布为 E2/3：17 %,E3/3：66%,E4/3 ：15%，E4/4：1% ，没有 E2/2 和 E4/2 型。等位基因频率分别为 2：8%, 3：84%,4：8% 。男女间等位基因频率经 2 检验差异无统计学意义（ 2
12、=1.81,P0.05） 。62.2 ApoE 基因型对髋部骨密度的影响携带 ApoE4 基因组 (E4/3 和 E4/4)和不携带 ApoE4 基因组(E3/2 和 E3/3)人群年龄、体重、身高和人体重指数（BMI）没有显著性差异。比较男性、女性携带 ApoE4 基因组和不携带 ApoE4 基因组间股骨颈、大转子和 Ward 区的第 1 次骨密度，经年龄、身高和体重校正后，差异没有显著性。2.3 ApoE 基因型对骨丢失的影响男女各组髋部骨密度第二次均明显低于第一次。经年龄、身高和体重校正，无论男女携带 ApoE4 基因组和不携带 ApoE4 基因组间股骨颈、大转子和 Ward 区的年骨丢
13、失率差异均无显著性统计学意义。表Apo E 基因型与髋部骨密度、骨丢失情况（略）注： 1)与本组第一次比较，P0.013 讨论本研究所分析人群的 ApoE 基因频率与国内研究报道的结果相似7，9，具有群体代表性。研究表明 ApoE4 基因型与一些疾病有关，本研究对象已排除可能与 Apo E4 基因型有关的疾病，如患有糖尿7病、甲状腺疾病、肾脏疾病等影响骨代谢的疾病,患有严重心血管疾病和高脂血症者也被排除。一些研究认为 AopE 基因型通过影响血浆维生素 K 和骨钙素水平调节骨代谢，ApoE2 型和 ApoE3 型者血浆维生素 K 水平高于ApoE4 型者，因此骨钙素羧化程度较高，有利于骨形成1
14、0。Masataka 等10 报道 ApoE4 等位基因与绝经后日本妇女低骨密度密切相关，携带 ApoE4 等位基因者骨密度低。Villarreal 等报道1携带 ApoE 型者骨丢失速率快，陶军和胡建华2，3均报道中国绝经后妇女原发性骨质疏松患症者 ApoE4 型等位基因频率明显高于正常对照者。但也有报道没有观察到 ApoE 基因型与骨密度的关系。Schoofs MW 等4对 5 857 名白人进行 2 到 7 年的跟踪没有观察到 ApoE4 基因型对髋部骨密度和骨丢失的影响。 Wong SY 等7 调查了香港人也没有发现 ApoE 基因型与髋部骨密度有关。本文结果显示该人群 ApoE 基因
15、型与髋部骨密度、骨丢失无明显相关性。由于 ApoE 基因型分布具有种族和地区差异，中国人 Apo E4 型携带者少，在本文中，研究对象人数 100 名，ApoE4 型携带者仅 16名可能影响结果。因此，关于 ApoE 基因多态性对骨密度和骨丢失的影响还需大样本长期的研究。8【参考文献】Villarreal E, Bermddez A. Polymorphisms of APO-E in Colombian women with osteoporosis: correlation with clinical and social risk variablesJ. Biomedica, 2004,
16、 24(1):50-55. 2陶军，许永武，都丽. 原发性骨质疏松症患者的栽脂蛋白 E 基因多态性J.中国临床康复，2006，10（40)：183-185.3胡建华，黄公怡，王晓霞, 等. 载脂蛋白 E 基因多态现象与原发性骨质疏松症相关性的初步研究J. 中华骨科杂志，1999,19（ 10）：597-599Schoofs MW, an der Klife M, Hofman A, et al. ApoE gene polymorphisms, BMD, and fracture risk in elderly men and women: the Rotterdam study J. J Bone Miner Res，2004, 19(9):1490-1496.5Otsuki T, Sakaguchi H, Hatt
