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1、浅谈 -内酰胺酶及其抑制剂摘要：随着抗生素药物使用的大量普及，抗生素耐药形势也日趋严峻。抗生素耐药的主要机制为产生 -内酰胺酶。-内酰胺酶依据分子结构中氨基酸序列差异可主要分为两类，分别是以丝氨酸为活性位点的 A、C 、D 类，还有以金属离子为活性位点的金属酶类。随着 -内酰胺酶的泛滥，一些 -内酰胺酶抑制剂应运而生。在治疗微生物感染时，常将抗生素与 -内酰胺酶抑制剂联用，治疗效果显著。本文将对 -内酰胺酶及其抑制剂进行简要的介绍。关键词：-内酰胺酶 -内酰胺酶抑制剂 细菌耐药 On the -lactamase and its inhibitorsAbstract ：With the inc
2、reasing popularity of the use of antibiotic, the situation of antibiotic resistance becomes worsening. The main mechanism of antibiotic resistance is due to the producing of -lactamase. -lactamase can be divided into two categories based on its amino acid sequence in molecular structure. The class o
3、f A, C, and D is of Ser active site while the class of B has metal ions in its active site. Some -lactamase inhibitor come into being because of the spreading of -lactamase. In the treatment of microbial infection, a number of commonly used antibiotics and -lactamase inhibitor were combined with fav
4、ored results. In this article, I will have a brief introduction of -lactamase and its inhibitor. Keywords : -lactamase -lactamase inhibitor antibiotic resistance1 抗生素耐药性及其耐药机制抗生素（antibiotic）是生物在其生命活动过程中产生的（以及用化学、生物、生物化学方法衍生的） ，能在低微浓度下有选择性抑制或影响它种生物功能的有机化合物。细菌耐药性（antibiotic resistance）是指细菌对抗生素不敏感的现象，又
5、可分为固有耐药（intrinsic resistance）和获得性耐药（acquired resistance） 。固有耐药是由细菌染色体基因决定、代代相传，不会改变的。如链球菌对氨基糖苷类抗生素天然耐药。获得性耐药是由于细菌与抗生素接触后，通过改变自身的代谢途径，使其不被抗生素杀灭。如本文将重点讨论的细菌对 -内酰胺酶的耐药性。抗生素的作用机制如下表所示：表一 抗生素的作用机制作用机制 代表抗生素干扰细菌细胞壁的合成，使其不能生长繁殖 -内酰胺类、万古霉素、环丝霉素损伤细菌细胞膜，破坏其屏障作用 多粘菌素 B、两性霉素 B、制霉菌素等影响细菌蛋白质合成， 四环素、氯霉素、大环内酯类等抑制核酸
6、合成或作用，影响核酸代谢， 利福霉素类、喹诺酮类、甲硝唑等抑制细菌代谢 磺胺药、甲氧苄氨嘧啶抑制结核环脂酸的合成 异烟肼图 1 抗生素的作用机制相对于抗生素的作用机制，微生物的耐药机制主要包括四部分：（1）-内酰胺酶的产生，也是主要的作用机制。（2）外膜通透性下降。（3）主动外排作用增强。（4）药物作用靶点的改变。图二 微生物耐药机制2 -内酰胺酶的分类及代表物通过上部分的介绍，我们知道微生物产生耐药性的主要机制为产生 -内酰胺酶，该酶通过水解 类抗生素的内酰胺环从而使抗生素失效。-内酰胺酶的分类标准主要有两类：Ambler 分类法和 BJM 分类法。前者主要依据 - 内酰胺酶分子结构中氨基酸
7、序列差异，后者则主要依据 -内酰胺酶的功能。2.1 Ambler 分类法图三 Ambler 分类法2.2 BJM 分类法（Bush-Jacoby-Medeiros）表二 BJM 分类法被抑制类别分子类型 CA EDTA 水解底物 代表酶1 C 类 - - 头孢菌素 G-菌的 AmpC2a A + - 青霉素 G+菌的青霉素酶2b A + - 青霉素、头孢菌素 TEM-1、TEM-2、SHV-12be A + -青霉素、窄谱与超广谱头孢菌素类、单环类TEM-3 至 TEM-26，SHV-2至 SHV-62br A - 青霉素 TEM-30 至 TEM-362c A + - 青霉素、羧苄西林 PS
8、E-1 、PSE-3、 PSE-42d D - 青霉素、氯唑西林 OXA-12e A + - 头孢菌素 普通变形杆菌的头孢菌素酶2f A + - 青霉素、头孢菌素、 碳青霉烯 阴沟肠杆菌的 NMC-A3a - + 青霉素、头孢菌素类 嗜麦芽黄单胞菌的 L13b - + 碳青霉烯类 产气单胞菌3cB- + 氨苄西林、头孢立啶 戈氏荧光杆菌4 未知 - 未知 青霉素 洋葱假单胞菌的青霉素酶-内酰胺酶丝氨酸-酶 金属-酶B 类染色体编码A 类 C 类质粒编码 染色体编码 质粒编码D 类3 -内酰胺酶与 - 内酰胺类抗生素的作用机制-内酰胺酶的作用机制由于其活性中心的不同主要分为两类，一类是以丝氨酸为
9、活性中心的酶，涉及 Ambler 分类法中的 A、C、D 类。另一类则是以金属为活性中心的酶，主要是 B 类。下面将分别加以介绍。3.1 丝氨酸活性酶-内酰胺酶与青霉素结合蛋白（PBPs）之间具有高度保守的氨基酸序列，它们与 D-丙酰氨-D- 丙氨酸转肽酶一起属于“青霉素识别酶”家族。A 、C、D类 -内酰胺酶在活性位点上都有丝氨酸，故又称活性位点丝氨酸酶。它们的氨基酸序列同源性不强，但酶分子的三级结构非常相似。下图就是 A 类 -内酰胺酶的三级结构图以及头孢菌素分子与它的作用机制图。A B图 4 (A)图为 A 类 -内酰胺酶活性部位结构图。其中，W1 为水分子。(B)图为头孢菌素分子与 -
10、内酰胺酶作用机制。如图 4 所示，由 4 个氨基酸残基组成的四联体 SXXK 位于 70-73 位点，其中 X 代表任意一种氨基酸，活性位点丝氨酸（Class A 为 Ser-70，Class C 为Ser-64）位于 A-螺旋的 N-端。由三个氨基酸残基组成的三联体 KTG 位于 -折叠上（Class A 为 Lys-234，Class C 为 Lys-315） ，另一个三联体 SDN 定位于130-132；KTG 和 SDN 之间通过氢键连接起稳定的作用。166-170 位点上数个氨基酸残基组成 环，环上氨基酸序列在 Class A 中高度保守， 环可将亲核水解反应所需的水分子准确定位。S
11、XXK、KTG、 SDN 和 环这几个结构域单元（motifs）之间的空间相对位置所形成的腔即为 -内酰胺底物与酶作用的“键合腔” （binding cavity ） ，A- 螺旋结构正好使丝氨酸活性位点 Ser-70 定位于键合腔的中央。Ser-70 的 OH、-NH 和 Ala-237 的-NH 共同形成 Oxyanion 盒(酰化反应点 )，-内酰胺环上的羰基在此与-OH 、 -NH 形成酰化酶复合物。Class A - 内酰胺酶在 244 位上有一个 Arg，具有定位另一个水分子的作用，此结构可水解含非典型 B-内酰胺环的底物如克拉维酸、舒巴坦；由于 Class C -内酰胺酶缺乏此结
12、构，对克拉维酸无效。整体上，Class A-内酰胺酶严整的“键合腔”结构和对水分子的精确定位能力使它能高效地水解底物.而 Class C -内酰胺酶的活性位点为 Ser 64 ,并且“键合腔”结构较为松散，更适于具有较大空间位阻的底物进入。Class D - 内酰胺酶的一级结构与 Class A 相似，其三级结构也具有类似于 Class A 的结构域单元（如 KTG 三联体等） ，虽然这些单元在其氨基酸组成和空间的相对位置上与 Class A 有一定差别，但一般认为其执行的功能是相同的。3.2 金属活性酶Class B- 内酰胺酶的结构与其它类型相比最大的不同在于金属离子可与氨基酸残基之间形成
13、配位化合物而干预活性位点上的反应，更为特殊的是不同的金属酶其所含的金属离子数目并不固定，从而造成本类酶与底物结合方式上的多样性。4 -内酰胺酶抑制剂的作用机制目前关于 -内酰胺酶抑制剂的作用机理尚不完全清晰。证明了 A 类、C类 -内酰胺酶（丝氨酸蛋白酶）都是由羧肽酶经由不同途径反应生成，从而证实了 - 内酰胺酶和羧肽酶与 -内酰胺类化合物具有相似的作用机制。大量的实验研究表明，A 类 -内酰胺酶中得 Ser 70 去亲核进攻 -内酰胺环上的羰基。但是目前对于活性点部位各残基参与酰化及去酰反应的角色尚有分歧。因此，对于 - 内酰胺酶抑制剂的作用机制不能进行详细的介绍。5 -内酰胺酶抑制剂的发展
14、目前应用较多的 内酰胺酶抑制剂主要是针对 A 类酶的，如克拉维酸 (Clavulanic acid)，舒巴坦 (Sulbactam)和泰唑巴坦(tazobactam)，这是三种临床上最常用的抑制剂。它们均为 -内酰胺衍生物，即它们与 -内酰胺抗生素一样，在结构中都存在一个 -内酰胺环。下面将进行详细的介绍。5.1 克拉维酸(Clavulanic acid)克拉维酸（结构式见图 5）的抗菌谱广，但活性很弱,其特点是能抑制革兰氏阴性菌和葡萄球菌产生的许多 -内酰胺酶，是第一个应用于临床的 -内酰胺酶抑制剂。目前临床上使用的 Augmentin 和 Timentin 就是它分别与羟氨苄青霉素和替卡西
15、林的复配制剂。图 5 克拉维酸结构式5.2 舒巴坦(Sulbactam)舒巴坦（结构式见图 6）属于青霉烷砜类的 -内酰胺酶抑制剂,也是第一个人工合成的此类抑制剂。图 6 舒巴坦结构式5.3 泰唑巴坦(tazobactam)他唑巴坦(结构如图 7)是从舒巴坦的衍生物中筛选出来的一种高效 -内酰胺酶抑制剂。它最早由 Hall 等人从 6-APA 出发制得，它的结构是在舒巴坦的基础上增加一个三氮唑环，以提高抑酶效果。它是目前临床效果最佳的 -内酰胺酶抑制剂。他唑巴坦与数种 -内酰胺类抗生素产生极其有效的协同作用，增加了 -内酰胺类抗生素的抗菌活性并扩大了其抗菌谱。它与哌拉西林的复方制剂是 1990 年至今唯一投放市场的青霉素类抗生素品种。图 7 泰唑巴坦结构式6 常用的 内酰胺类抗生素酶复合制剂奥格门丁 克维 阿莫西林 或 1/4 特美汀 克拉 替卡西林 1/1.5 优立新 舒巴 氨苄西林 舒他西林 舒 氨苄西林 1/1 舒普深 舒巴 头胞哌酮 1/1他唑西林 他唑 哌拉西林 1/8舒 头胞他啶
