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1、1美金胺对缺血性脑损伤保护作用的研究【摘要】 目的 观察美金胺对 SD 雄性大鼠全脑缺血/ 再灌注后海马CA1 区锥体细胞的保护作用，并研究其可能的机制。方法 采用四动脉结扎法建立大鼠全脑缺血模型，缺血 15 min 后分别灌注 6 h或 5 天。大鼠随机分为假手术组、缺血 /再灌注组、缺血 /再灌注给药组和缺血/再灌注溶剂对照组。缺血/再灌注给药组腹腔注射 20 mg/kg 美金胺。使用免疫印迹、免疫沉淀和焦油紫染色法等技术检测相关信号蛋白的表达、活化水平及神经元细胞的死亡。结果 大鼠缺血/再灌注 5 天后，缺血 /再灌注给药组海马 CA1 区细胞的存活数量较缺血/再灌注组和缺血/再灌注溶剂
2、对照组明显增加；缺血/再灌注 6 h，缺血/ 再灌注给药组 N-甲基-D- 天门冬氨酸(NMDA)受体亚基 2A (NR2A)、突触后密集区蛋白 95(PSD-95)、非受体型蛋白酪氨酸激酶(Src) 三者间免疫沉淀的蛋白量及 NR2A 的酪氨酸磷酸化水平较缺血/再灌注组和缺血/再灌注溶剂对照组明显降低，而三者的表达量没有明显变化。结论 美金胺通过抑制 NR2A、PSD-95、Src三者结合及 Src 介导的 NR2A 的酪氨酸磷酸化抑制了缺血后NMDA 受体功能的增强，从而对大鼠缺血性脑损伤有保护作用。 【关键词】 脑缺血/再灌注 美金胺 NMDA 受体 NR2A Src Abstract:
3、 Objective To evaluate the neuroprotection of memantine against cerebral ischemia in SD rat models, and investigate the underlying mechanism. Methods Rats were 2randomly assigned to 4 groups: sham-operation group, ischemia/reperfusion group, vehicle control group and drug test group. Transient brain
4、 ischemia (15 min) and reperfusion was induced by the four-vessel occlusion method (4-VO). The experiment was performed by using IB, IP and morphologic methods to examine the expression of relevant message proteins and the survival of hippocampal neurons. Results Transient cerebral ischemia/reperfus
5、ion induced obvious neuronal death, which could be improved by the use of memantine. It was also found that memantine inhibited the interactions between NR2A, Src and PSD-95, and decreased the tyrosine phosphorylation of NR2A. Conclusions The neuroprotective effects of memantine against cerebral isc
6、hemic/reperfusion damage are pathologically confirmed in SD rats models. And the mechanism may involve the tyrosine phosphorylation of NR2A by Src. Key words: cerebral ischemia/reperfusion; memantine; NMDA receptors; NR2A; Src 近年来脑缺血损伤的发病机制被认为主要是 N-甲基-D-天门冬氨酸(NMDA)受体的兴奋毒作用。研究报道 NMDA 受体的非竞争性拮抗剂美金胺(me
7、mantine) 可以抑制 NMDA 受体在病理条件下的过度增强，其作用与阻滞通道过度开放有关1 ，但其作用的具3体机制仍没有充分阐明。本实验采用大鼠全脑缺血/再灌注模型研究美金胺对脑缺血的神经保护作用，并探讨其可能的作用机制。 1 材料和方法 1.1 实验动物 清洁级雄性 Sprague-Dawley (SD)大鼠，250 300 g，由徐州医学院实验动物中心提供。随机分为 4 组：假手术组(Sham) 、缺血 /再灌注组(ischemia/reperfusion, I/R)、缺血/再灌注溶剂对照组(Saline)、缺血/再灌注给药组(Memantine)。 1.2 实验方法 1.2.1 动
8、物模型制备 按本实验室已建立的大鼠四动脉结扎模型，动物以 20%水合氯醛(300350 mg/kg)腹腔注射麻醉后，分离双侧颈总动脉，电凝椎动脉。手术第 2 天动物于清醒状态下结扎双侧颈总动脉，全脑缺血 15 min，再灌注 6 h 或 5 天。缺血后立即给予腹腔注射药物或溶剂，以体征表现判断缺血模型的可靠性2 。假手术组不结扎双侧颈总动脉。 1.2.2 给药 美金胺溶于生理盐水中，缺血/ 再灌注给药组在缺血后立即腹腔注射给药 20 mg/kg；溶剂对照组给予等体积生理盐水。1.2.3 样品制备 大鼠再灌注 6 h 后，断头快速取脑，分离双侧海马，沿海马裂将其 CA1 部分分离出来，置液氮中冻
9、存备用。以下操作均在冰水浴中进行：从液氮中取出海马加匀浆缓冲液，用 Teflon匀浆器高速匀浆（10 s6 次） ， 1 000 g 于 4 离心 15 min，小心移取上清液（主要为海马的胞质部分） ，置-80冰箱待用。 41.2.4 蛋白浓度测定 采用改良 Lowrys法，以牛血清白蛋白(BSA, fraction )为标准蛋白。 1.2.5 免疫沉淀(immunoprecipitation, IP) 以下操作均在 4条件下进行：含相同蛋白量（400 g）的样品中，加入 0.35 ml IP 缓冲液，12 g抗体 anti-NR2A，旋转混匀器上反应 4 h 或过夜，再加入 25 l 蛋白
10、 A，旋转混匀器上反应 2 h，12 000 g 离心 2 min，沉淀用 IP 缓冲液洗 3 遍。加入 1/3 体积 4蛋白上样缓冲液，混匀后置沸水浴中 5 min 以洗脱蛋白 A 上结合的蛋白， 12 000 g离心 2 min，吸取上清液用于免疫印迹。 1.2.6 免疫印迹 (immunoblot, IB) 含相同蛋白量的样品中加入1/3 体积 4蛋白上样缓冲液，置沸水浴中 5 min 变性处理。取等量的变性蛋白质样品(100 g)或 IP 处理后样品，经 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE)分离后，电转移至硝酸纤
11、维素(NC)膜上。将 NC 膜置封闭液中室温孵育 3 h 后，分别加入一抗 anti-pY、anti-NR2A、anti-PSD-95 或 anti-Src 工作液，4孵育 4 h 或过夜，TBST 洗膜（ 5 min3）后，加入 AP标记的二抗工作液，室温孵育 2 h，TBST 洗膜（3 min5） ，水洗。使用 NBT/BCIP 试剂盒，在新鲜配制的 AP 显色液中显色，流水洗涤终止反应。扫描膜上显色条带并以 Quantity One 软件分析处理。1.2.7 组织学检查 再灌注 5 天时，以水合氯醛麻醉大鼠，接着以生理盐水和 4%多聚甲醛进行心室灌注，然后取脑块放于 4下 4%多5聚甲醛
12、中固定 1 天。 梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋。取海马齿状回互包段连续冠状切片，片厚 5 m,切片经脱蜡、晾干, 0.1%焦油紫(cresyl violet)染色 1020 min，梯度乙醇分色，光镜下观察神经元呈紫色而背景基本无色为止，脱水、透明、封片。显微镜下计数 CA1 区 1 mm 宽度内的存活锥体细胞。 1. 3 统计学处理 数据以s 表示，应用 SigmaStat 统计软件，采用单因素方差分析(ANOVA)，P0.05 为差异有统计学意义。 2 结 果 2.1 缺血/再灌注 5 天海马 CA1 区锥体细胞的存活量 光镜下可见：Sham 组、Memantine 组海马 CA1
13、区细胞分布均匀整齐；I/R组和 Saline 组出现大量死亡细胞，存活细胞较少，表现为细胞破碎、核固缩、溶解(图 1)。各组大鼠脑缺血/再灌注后海马 CA1 区细胞存活量统计结果见表 1。与 I/R 组相比，Memantine 组存活细胞明显增加(P0.05)。 表 1 缺血/ 再灌注 5 天后各组大鼠海马 CA1 区锥体细胞存活数与 I/R 组比较：*P0.05 2. 2 缺血/ 再灌注 6 h 海马 CA1 区 NR2A、PSD-95、Src 三者的结合及 NR2A 的酪氨酸磷酸化水平的变化 由图 2、3 可知，以anti-NR2A 免疫沉淀，anti-pY、anti-PSD-95 、an
14、ti-Src 免疫印迹，在缺血/再灌注 6 h，Memantine 组海马 CA1 区 NR2A、PSD-95、Src 三者相互免疫沉淀蛋白量及 NR2A 的酪氨酸磷酸化水平较I/R 组明显降低；以 NR2A、PSD-95, Src 三者抗体直接免疫印迹的结果各组均没有明显变化。 63 讨 论 缺血性神经细胞损伤相当一部分是由谷氨酸受体中的 NMDA 受体的过度活化介导的，它的活化引起通过膜受体离子通道内流的Ca2+大量增加，导致神经元死亡。而 NMDA 受体功能受到 Src 激酶介导的受体亚基 NR2A 的酪氨酸磷酸化水平的调节3 。然而，NMDA 受体的生理性活化状态对于正常神经元的功能也
15、非常重要。这就意味着那些完全抑制 NMDA 受体活性的具潜在神经保护作用的药物极有可能在临床上产生不可耐受的副作用4 。 而金刚胺的衍生物美金胺，作为一种非竞争性、低亲和力、开放性的通道阻滞剂，优先抑制 NMDA 受体的过度活化，而不影响正常的受体活性。当受体离子通道过度开放时，它优先进入通道；更重要的是，它的解离速率快，不会持续积聚在通道上干扰随后正常的突触传递，理论上应用相对安全5 。有报道美金胺对脑缺血缺氧损伤和其他多种神经损伤都具有脑保护作用1 ，比如阿尔茨海默病和血管性痴呆4 。它作为抗帕金森病的新药近年来在欧洲广泛应用，罕见副作用的报道6-7 。 同时，脑缺血方面的研究证实美金胺对
16、新生鼠缺血缺氧性脑损伤8具有神经保护作用，并且对实验动物的认知能力没有产生明显副作用9 。已知在脑缺血 /再灌注 6 h，NMDA 受体亚基NR2A、PSD-95、Src 三者结合增加，NR2A 的酪氨酸磷酸化水平增加10 ，从而上调 NMDA 受体的功能，导致 Ca2+内流增加，最终引起神经元的死亡。本实验中，我们在诱导全脑缺血后立即给7予美金胺，通过免疫沉淀和免疫印迹结果显示美金胺能够抑制缺血/再灌注 6 h NR2A、PSD-95、Src 三者的结合及 NR2A 酪氨酸磷酸化的增加，提示其抑制了缺血后 NMDA 受体的功能。而焦油紫染色结果也显示美金胺明显减少了再灌注 5 天后海马 CA1 区锥体细胞的死亡，证明在全脑缺血发生后立即给予美金胺使 NR2A 的酪氨酸磷酸化减少，抑制了 NMDA 受体的功能，拮抗了 NMDA 受体的过度激活，从而对神经细胞具有保护作用。在全脑缺血损伤发生后给予美金胺对神经细胞仍然具有保护作
