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1、1罗格列酮对人乳腺癌 MDAMB231细胞的体外抗肿瘤作用作者：章涛 余华荣 杨贵忠 刘颖菊 杨俊卿 蒋建新 周岐新【摘要 】 目的：研究过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）激动剂罗格列酮对人乳腺癌细胞 MDAMB231 体外生长影响，以评价其在人乳腺癌治疗上的应用潜力. 方法：噻唑蓝(MTT)法检测罗格列酮对 MDAMB231 细胞体外生长抑制作用；应用 PPAR 拮抗剂 GW9662，分析罗格列酮对 MDAMB231细胞增殖影响与 PPAR 受体关系；流式细胞仪分析细胞周期，Annexin VFITC 和 TUNEL 法检测细胞凋亡. 结果：罗格列酮干预下 MDAMB231 细胞 G0/
2、G1 期比例上升，而 S 期比例下降，呈量 效关系抑制其生长，IC50=5.2 mol/L. PPAR 拮抗剂GW9662 可部分逆转罗格列酮对 MDAMB231 细胞增殖抑制作用（P0.05）. 结论：罗格列酮通过 PPAR 介导，使 MDAMB231 细胞 G1 期阻滞而抑制其增殖，高浓度时还可诱导其发生凋亡，罗格列酮有望成为治疗乳腺癌的有效药物. 2【关键词】 过氧化物酶体增殖物激活受体 罗格列酮 抗肿瘤药 乳腺肿瘤 MDAMB231 细胞0 引言由罗格列酮、吡格列酮和环格列酮等组成的噻唑烷二酮类（thiazolidinedione，TZD）人工合成过氧化物酶体增殖物激活受体 （pero
3、xisome proliferatoractivated receptor ，PPAR)激动剂已被广泛应用于糖尿病的临床治疗当中1.近年来的研究显示，TZD 等 PPAR 激动剂可抑制多种肿瘤细胞的增殖并促进其凋亡，激活 PPAR 受体极有希望成为治疗多种恶性肿瘤的新途径2. 但目前为止，尚无罗格列酮对人 MDAMB231 乳腺癌细胞体外抗肿瘤的系统研究报道.鉴于此，我们就细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡等方面探讨罗格列酮对 MDAMB231 细胞的体外生物学效应，为未来临床抗肿瘤应用提供理论依据.1 材料和方法1.1 材料 MDAMB231 人乳腺癌细胞株购自中科院上海细胞库. 罗格列酮购自重庆
4、康尔威药业公司（批号:20051 ，纯度0.99） ；四甲基偶氮唑蓝（ MTT） 、PPAR 受体拮抗剂GW9662 购自 Sigma 公司； TUNEL 细胞凋亡原位检测试剂盒购3自南京凯基生物；Annexin VFITC Kit 为 Beckman Coulter 公司产品；RPMI1640 培养基、小牛血清购自 HyClone 公司；其它试剂均为分析纯. Coulter counter 细胞计数仪（Beckman Coulter 公司） ；Safire 全波长酶标仪（TECAN 公司） ；FACS Calibur 流式细胞仪（BectonDickinson 公司）. 由于罗格列酮和 GW
5、9662 难溶于水，用 DMSO 制成 0.1 mol/L 的母液，-20 冰箱保存备用.1.2 方法1.2.1 细胞培养 MDAMB231 细胞培养于含 100 mL/L 小牛血清的 RPMI 1640 培养基中，常规加入青霉素（105 U/L）与链霉素（100 mg/L） ，于 37, 50 mL/L CO2 培养箱中培养.1.2.2MTT 检测细胞增殖抑制率取对数生长期的 MDAMB231细胞，计数并调整密度为 1.2108/L，以每孔 100 L 接种于 96 孔板中培养，15 h 后更换培养基，设置对照组和不同浓度药物组（罗格列酮 110-8，110-7，110-6，110-5，11
6、0-4 mol/L） ，每组设 8 个复孔.继续培养 24 h 后，加入 10 L MTT（5 g/L） ，继续孵育 4 h，弃上清，每孔加入 100 L DMSO，振荡 10 min 待结晶溶解，于酶标仪上测定 570 nm 波长的 A 值，计算不同浓度罗格列酮对 MDAMB231 细胞的生长抑制率：细胞抑制率（% ）= 1试验组 A570 nm/对照组 A570 nm100.将药物浓度的4对数值和抑制率拟合后计算出 IC50.试验重复 3 次.1.2.3 细胞增殖能力检测取对数生长期细胞，细胞计数并调整密度为 5107/ L，以每孔 1 mL 接种于 6 孔板中培养.第 2 日更换含不同药
7、物组合的新鲜培养基，包括 1 mL/L DMSO, 1 mol/L 罗格列酮、5 mol/L GW9662 以及 1 mol/L 罗格列酮与 5 mol/L GW9662 联用共 4 个组，每 48 h 更换含相应药物的新鲜培养基.分别于用药后第 2，4，6 日收集细胞计数，每组计 3 个复孔，求其平均值. 试验重复 3 次.1.2.4 细胞周期分析取对数生长期细胞，调整密度为 3108/ L，以每孔 1 mL 接种于 6 孔板中培养.第 2 日更换含不同浓度罗格列酮（110-6，110-5，110-4 mol/L）的新鲜培养基，继续培养24 h 后消化收集细胞，PBS 洗涤一次，750 mL
8、/L 乙醇固定，4 冰箱保存.检测前用 PBS 洗 2 次，PI 染色，流式细胞仪（FCM）检测群体细胞中 G0/G1, S, G2/ M 各期细胞百分比 .每个药物浓度做 3个复孔，同时设不加药物的对照组.1.2.5Annexin V/PI 法流式细胞仪检测细胞凋亡细胞接种密度及用药同细胞周期检测.罗格列酮作用 24 h 后消化收集细胞，PBS 洗2 遍，用 100 L 结合缓冲液重悬细胞，加 5 L Annexin VFITC和 2.5 L PI，混均，避光于冰上孵育 10 min，PBS 洗 1 次，400 5L 结合缓冲液重悬细胞，细胞样品逐一上机检测，同一浓度设 3 个复孔，试验同时
9、设置不加药物的空白对照组.1.2.6TUNEL 法检测细胞凋亡将预铺多聚赖氨酸的盖玻片放入 6孔培养板中，每孔接种 3105 个细胞，第 2 日更换为含 110-6，110-5，110-4 mol/L 3 种不同浓度罗格列酮的新鲜培养基.药物作用 36 h 后弃培养液， PBS 洗 1 次，40 g/L 多聚甲醛室温固定 25 min，按照原位检测试剂盒说明操作，最后以 DAB 显色、甲基绿衬染，每个浓度作 2 个复孔.在高倍镜（ 200）视野下，随机选取 10 个视野，以凋亡细胞在全部细胞中所占的比例计算凋亡率 .统计学处理： 实验数据以 xs 表示，用 SPSS 13.0 软件包对实验数据
10、进行单因素方差分析(oneway ANOVA)，并用 LSDt 检验进行均数间的多重比较.2 结果2.1 对 MDAMB231 细胞体外增殖的影响对细胞生长的抑制作用随药物浓度增加而加剧，呈明显的量 效关系, 除 110-8 和110-7 mol/L 2 个浓度间的抑制率比较无统计学差异外(11.22.0)%, (15.52.5)%, P0.05 ，其余各组之间均存在统计学差异(32.13.2)%, (62.05.1)%, (74.96.4)%, P 均60.01）. IC50 为 5.2 mol/L.2.2 对 MDAMB231 细胞周期的影响随着罗格列酮浓度的增高，G0/G1 期细胞在细胞
11、周期中所占的比例逐步上升，而 S 期细胞比例逐渐降低（表 1） .2.3 罗格列酮抑制 MDAMB231 细胞增殖与 PPAR 受体的关系给药后第 2, 4, 6 日，罗格列酮（1 mol/L）组细胞计数（起始接种细胞数为 5104 个/孔）分别为(1.060.14)105 ，(3.850.69)105 和(7.451.30)105 个/孔，与 1 mL/L DMSO 对照组(2.460.44)105，(17.101.69)105 和(28.822.79)105 个/孔比较，两组差异具有统计学意义(P 均0.01)；而 PPAR 受体拮抗剂 GW9662（5 mol/L）与罗格列酮（1 mol
12、/L）联用组的细胞计数分别为(1.720.20)105，(6.630.58)105 和(11.901.21)105 个/孔，高于罗格列酮组（P 均0.05）.表 1 罗格列酮对 MDAMB231 细胞周期分布的影响（n=3，%, xs）组别 G0/G1SG2/M 对照61.14.928.73.410.21.7 罗格列酮(mol/L)110-6769.56.421.82.3b8.71.1110-5 b79.96.615.81.84.30.6110-4 b94.73.73.50.61.80.2bP0.01 vs 对照.2.4 罗格列酮诱导 MDAMB231 细胞凋亡对照组细胞的凋亡发生率为(0.6
13、0.2)%，而 10-4 mol/L 罗格列酮处理 24 h 后细胞凋亡发生率上升至(16.62.7)% (P0.05）.3 讨论近年来发现，包括 TZD 在内的一些 PPAR 激动剂能抑制多种肿瘤细胞的增殖，其抗肿瘤机制还不甚明了，可能涉及肿瘤细胞增殖、 细胞凋亡和细胞分化 A: 110-4 mol/L 罗格列酮处理 36 h； B: 阴性对照组（不加 TdT 酶）.等多方面的调节机制.曲格列酮可诱导肝癌细胞周期素依赖蛋白激酶（CDK）抑制因子 P21 的表达，使细胞出现 G1 期阻滞3 . 在对大鼠 C6 神经胶质瘤细胞的研究中发现，PPAR 激动剂环格列酮和 PGJ2 可使促凋亡蛋白 B
14、AX 和BAD 表达上调，通过细胞色素 C 的释放和随后激活几种 caspases8蛋白而引发细胞凋亡4.研究表明，小鼠和人乳腺组织以及人乳腺癌细胞系均表达PPAR，我们的研究也证实 MDAMB231 人乳腺癌细胞表达PPAR. Yin 等5报道，曲格列酮可下调人乳腺癌 MCF7 细胞cyclin D1 的表达，致使 Rb 蛋白磷酸化受阻，引发细胞周期的捕获，G1 期细胞比例增加，从而抑制细胞增殖. 本研究表明，110-6 mol/L 的罗格列酮即可显著抑制 MDAMB231 细胞的增殖，随着药物浓度的增高，罗格列酮对 MDAMB231 细胞的生长抑制效应增强，量 效关系明显；并且 G0/G1 期细胞比例也随药物浓度的增加而增高，说明罗格列酮可通过细胞周期捕获而抑制MDAMB231 细胞增殖.MDAMB231 为雌激素受体阴性乳腺癌细胞，对激素治疗不敏感，治疗效果不佳，寻找新的治疗策略和药物显得尤为迫切.目前为止，有关 TZD 对 MDAMB231 的作用研究还极为欠缺. 由于曲格列酮肝毒性发生率高，采用曲格列酮治疗乳腺癌的期临床实验也因此被终止6.罗格列酮是 PPAR
