《维生素C增强As2 O3 诱导宫颈癌HeLa细胞凋亡的研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《维生素C增强As2 O3 诱导宫颈癌HeLa细胞凋亡的研究（16页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1维生素 C 增强 As2 O3 诱导宫颈癌 HeLa 细胞凋亡的研究摘要目的: 探讨维生素 C 是否能影响三氧化二砷（As 2 O3 ）诱导宫颈癌 HeLa 细胞凋亡，以及它对细胞内端粒酶活性的影响。 方法: 用噻唑蓝（MTT）法筛选出维生素 C 的最佳浓度250molL -1 ，并用该浓度联合不同浓度的 As2 O3 同时处理 HeLa 细胞后，用光镜、MTT 法和流式细胞术研究细胞生长和凋亡的情况，用 TRAP.ELISA 法检测细胞内端粒酶活性的变化。 结果: 单独 1molL -1 As2 O3 处理过的细胞生长未受到明显抑制，但联合 250molL-1 维生素 C 处理细胞，则细胞
2、生长受到抑制，且部分细胞出现凋亡形态学特征。2、5 、10molL-1 As2 O3 联合维生素 C 用药组的细胞凋亡率也比单独用 As 2 O 3 组明显增高，且出现凋亡的时间提早。端粒酶活性检测结果提示，联合用药组细胞内端粒酶活性均明显比单独用 As2 O3 组低。 结论: 小剂量维生素 C 能增强 As2 O 3 诱导宫颈癌 HeLa 细胞凋亡，并能增强 As2 O3 对细胞内端粒酶活性的抑制作用。 关键词 维生素 C;三氧化二砷;HeLa 细胞;细胞凋亡;端粒酶维生素 C 是自然界广泛存在的一种抗氧化剂，但近来研究表2明维生素 C 不仅有抗氧化作用而且表现出一定的亲氧化作用1 。三氧化
3、二砷（As 2 O3 ）是中药砒霜的主要成分，具有一定的抗肿瘤作用。最近有研究显示维生素 C 可增强 As 2 O3 诱导白血病细胞凋亡的作用2 4 ，这种增强作用被认为可能与降低细胞内还原型谷胱甘肽（GSH）水平和提高细胞内活性氧类（re-active oxygen species，ROS）水平有关3 ，4 ，但具体机制不十分明确。本研究小组前期的工作显示 As2 O3 能诱导宫颈癌 HeLa 细胞凋亡，这一作用可能与其抑制端粒酶活性有关5 。本研究旨在进一步研究维生素 C 对 As2 O3 诱导 HeLa 细胞凋亡的影响，以及维生素 C 联合 As2 O3 对宫颈癌 HeLa 细胞内端粒酶
4、活性的影响。1 材料和方法1.1 试剂 As2 O3 （Sigma）用 1mmolL-1 NaOH 将其完全溶解，调 pH 至 7.2，用灭菌双蒸水配制成10mmolL-1 溶液，4贮存，使用时用 RPMI1640 培养液稀释为工作浓度。噻唑蓝（MTT）和 HEPES 购自 Amresco 公司，RPMI1640 培养基（粉剂）购自 Gibco 公司，维生素 C 购自 Sig- ma 公司，小牛血清购自杭州四季青公司，TRAP.ELISA 试剂盒来自Roche 公司，RT.PCR 试剂盒来自 Promega 公司。31.2 细胞培养及形态观察 HeLa 细胞株购自中国科学院上海细胞生物研究所细
5、胞库，用含 10%小牛血清和 100Uml-1 青霉素、100Uml -1 链霉素和 HEPES 的 RPMI1640 培养液，在 37、体积分数为 0.05 的 CO 2 培养箱中培养，每隔23d 传代 1 次。实验选用对数生长期的细胞，用 0.25%胰酶和0.02%EDTA 混合消化液消化，用培养液稀释成单细胞悬液，以4000 个细胞孔-1 接种于 96 孔板中，1624h 用以下两种方法处理:一种单加不同浓度（1、2 、 5、10molL -1 ）As 2 O 3 ，另一种 250molL -1 维生素 C 加不同浓度（1、2、5、10molL -1 ）As2 O3 ，不加药组作为空白对
6、照，每组 6 个平行孔，加药后每天用相差显微镜观察并记录用药组和对照组的细胞形态变化。1.3 MTT 检测1.3.1 维生素 C 浓度的筛选 细胞准备方法同 1.2。1624h分别按以下分组加药:2molL-1 As 2 O 3 组、2molL-1 As2 O 3 加不同浓度（62.5、125、250 、 500、750、1000、2000 、4000molL -1 ）维生素 C 组和对照组（未加药） ，再在同样条件下培养48h 后每孔加入 20l MTT（质量浓度为 5gL -1 ，用0.01molL -1 的 PBS 配制）后在同样条件下培养 4h，弃4去孔内液体，每孔加入 150l DM
7、SO，振荡 10min，在酶标仪（Multiskan MK3.353）上测定波长为 492nm 处的光吸收值（A） ，每组设 6 个平行孔，取平均值，以（实验组 A 值.对照组 A 值）100%计算细胞存活率。实验重复 3 次以上。1.3.2 不同浓度 As2 O3 联合维生素 C 对细胞生长的影响细胞准备方法和药物处理方法同 1.2。药物处理细胞 48h 后作 MTT 检测（同 1.3.1） ，实验重复 3 次以上。1.4 流式细胞术检测选用对数生长期 HeLa 细胞制备成单细胞悬液，每瓶接种 5105 个细胞，1624h 用以下两种方法处理:一种单加 As 2 O 3 （0、5molL-1
8、 ） ，另一种250molL-1 维生素 C 加 As2 O 3 （0、5molL-1 ） ，在此条件下培养 48h 后消化液消化，Hank 液终止消化收集细胞;PBS 洗 2 次，1000rmin-1 离心 5min，将 70%冷乙醇缓慢滴入试管，并不停震荡试管，使细胞分散固定;PBS 洗涤后弃上清，加入 1%Triton-X.100，摇匀后静置 10min，1500rmin-1 离心 5min，弃上清;加入0.01%Rnase 消化 10min，1500rmin-1 离心 5min，弃上清; 加入 0.005%的碘化丙锭染色 15min，用 300 目丝网过滤后上机分析（FACS Vant
9、age SE 型，B.D 公司生产） 。每样本设立 3 管重复样本。51.5 端粒酶活性检测端粒酶的活性检测按 Roche 公司提供的说明书操作。选用对数生长期 HeLa 细胞制备成单细胞悬液，每瓶接种 510 5 个细胞，培养 1624h 加药处理（方法同 1.2） 。48h后收集细胞，用 PBS 洗两次，43000rmin-1 离心5min;沉淀细胞中加入端粒酶提取液 200l，冰上孵育 30min 后416000rmin-1 离心 20min，取上清液（为确保无沉淀物误吸，一般只吸取 150l）置于另一 Eppendorf 管中，-70保存; 取 2l 上清液，再加入 25l TRAP.
10、PCR 扩增液（包括正义引物 TS、反义引物 CX、Taq 聚合酶、dNTPs、镁离子等） ，用 DEPC水补充体积至 50l，瞬时离心后在 PCR 仪（ PTC.100，MJ Research）上延伸和扩增;PCR 扩增程序为 :引物延伸（2530min） ，端粒酶灭活（945min） ，扩增反应（变性 9430s ，复性 5060s，延伸 7230s，30 个循环，72延伸 10min） 。取上述 PCR产物 5l，加变 性液 20l，混匀，置室温 10min，加入 225l 杂交液（含地高辛标记探针） ，混匀后取 100l 加入抗生物素覆盖过的微孔板中，37混匀杂交 2h;每孔加入 10
11、0l 过氧化物酶偶联的抗地高辛抗体（anti-DIG.POD） ，室温下混合反应 30min;每孔加入100l POD 酶的底物 TMB（3，3，5，5-tetramethyl benzidine） ，室温下混合反应 15min 后加 100l 终止液终止反应，在酶标仪上测定 450 和 690nm 波长处的 A 值。A 差值A=A 450 -A 690 代表细胞内端粒酶活性。阳性对照为试剂盒提供的人胚肾6293 细胞株的端粒酶提取液，其 PCR 产物经 ELISA 检测，A1.5为阳性。阴性对照为 HeLa 细胞提取液，于 65加热 10min 以灭活端粒酶，其 PCR 产物经 ELISA
12、检测，A0.05（图 2A） 。同时我们在检测单独不同浓度的维生素 C 对8HeLa 细胞的影响时发现，单独 500molL-1 维生素 C也能诱导 HeLa 细胞凋亡（结果将另文发表） ，而单独250molL -1 维生素 C 却不能诱导 HeLa 细胞凋亡，因此我们选定 250molL-1 维生素 C 作为我们的联合用药浓度。2.2.1.2 不同浓度 As 2 O3 联合维生素 C 对细胞的影响 经不同浓度的 As2 O3 单独处理 HeLa 细胞 48h，以及其联合250molL-1 维生素 C 处理 HeLa 细胞 48h 后进行MTT 检测。我们发现，单独 1molL-1 的 As2 O3 作用于 HeLa 细胞 48h 对细胞增殖影响不十分明显，但联合250molL-1 维生素 C 作用后细胞存活率则明显降低;2、5 、10molL-1 的 As2 O 3 联合250molL-1 维生素 C 处理细胞的存活率均比单独 As 2 O3 处理组低，且随着 As 2 O3 浓度的加大差异越来越显著（图2B） 。1. 对照组（为 100%）;2.2molL-1 As2 O 3 组;3 10. 分别对应2molL-1 As2 O3 联合62.5
