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1、硝酸纤维素膜微粒 ELISA 方法的建立1方法1.1 混合抗原直接测试按文献报导方法 1 ，将 1.2ml 鼠原血清加入 7.0ml10丙烯酰胺溶液，聚合后在 10C、200mA、2h 条件下大鼠血清蛋白电泳吸附于 NC 膜，用蒸馏水漂洗后，切一 10100mm 小条装入 10ml 试管备用。对照组将同样面积空白 NC 膜用蒸馏水漂洗后备用。在上述装有 NC 膜的试管中加入10ml DMSO，充分摇匀，室温 1h；加入等体积 01molLpH9 0 碳酸氢钠溶液，充分混匀。3000rmin 离心 35min ，收集沉淀，即 含大鼠血清蛋白的 NC 膜微粒，用 001molL pH7.4 PBS
2、-T 洗涤离心 35min；用含 0.3的 1：50 正常羊血清封闭、阻断 37C30min 或 4C 冰箱过夜；同上离心后用 PBS 将微粒体积调至 5ml、用 0.5ml 离心管分装，每管加入 100l 微粒悬浊液；在各管中分别加入 100l 倍比稀释的 HRP-羊抗鼠，37C 孵育 30min；同上洗涤离心 3 次，加入 100l 含 0.1molL 柠檬酸、0.2molL 磷酸氢二钠、双氧水、邻苯二胺底物溶液，于 37C 暗环境反应 120min；每管加入 1 滴 2molL 硫酸终止反应，同上离心，收集上清并加入 96 孔酶联板，用酶标仪测试波长490nm 处 OD 值。重复测试 3
3、 次。1.2 电泳 分离抗原测试 首先免疫转印鉴定抗原，再根据免疫转印结果进行定位，将特定抗原带裁下，测量 NC 膜面积，同上将 NC 膜微粒化处理并进行定量免疫测试。2结果用混合抗原直接测试和用电泳分离抗原进行测试，抗体浓度与 OD 值间均有较好线性关系，当抗体浓度为 0.2510ngml 时线性最好，且阳性组和阴性对照组 OD 值落在最佳范围（见表 1），即阴性对照组 OD 值为 0.3 左右，阳性对照组为 1.0 左右。3 次重复结果一致。表 1NC 膜微粒 ELISA 法测试羊抗鼠 IgG 抗体浓度（ng ml）与 OD 值（ Tab 1Concentration of goat an
4、ti-mouse IgG antibody test withmicro-particles ELISA method（ 全屏显示表格 OD vs concentration of antibody in each GConcentration of goat anti-mouseIgG antiboby Negative G Direct absorb G* Western blot G0.0625 0.0040.000 0.0700.015 0.0600.0120.1250 0.0670.009 0.3490.055 0.3170.0400.2500 0.1790.026 0.7520.1
5、62 0.7000.1520.5000 0.3340.045 1.1730.563 1.1700.5041.0000 0.4920.048 1.6970.220 1.5970.2202.0000 0.6820.075 2.4930.325 2.2940.301*tested with complex antigen； tested with electrophoresis isolated antigen 3讨论用 ELISA 法进行测试时，包被条件非常关键，对用于包被的抗原或抗体要求较高，其应用范围受限制 NC 膜具有很强的吸附能力，从而出现了以该材料基础的斑点免疫检测法 24 。其对被吸附
6、的抗原要求不高，粗制抗原便可用于检测，但吸附时间长、费时，被吸附抗原如果含有表面活性剂便不能用于检测。为了克服上述缺点，我们曾建立了 电泳吸附斑点免疫法 1 ，但该法需要将 NC 膜逐一截成小圆片放入酶联板中，操作也不方便，定量不够准确。NCMPE 法将电泳吸附抗原的 NC 膜变成微颗粒，分装方便，能保证其均一性，定量准确，由于在离心管中操作、洗涤等处理极为方便。免疫转印技术是抗原抗体检测方面的重 突破，但应用该方法难以将抗体定量。NCMPE 法将免疫转印识别的特定抗原带处理成微颗粒，然后用 ELISA 法定量测试抗体水平，充分发挥了免疫转印技术的高分辨率和 ELISA 定量法的高度精确性与高
7、度灵敏性，可极为方便而准确地将某种未知抗体定量。第四节ELISA 的技术要点ELISA 的技术要点包括三 方面：试剂的制备、 反应条件的选择和操作的标准化、试剂的制备ELISA 的主要试剂 固相的抗原或抗体 、酶标记的抗原或抗体和与标记酶直接关联的酶反应底物。以下叙述 些试剂的原料和制备方法。（一）固相载体可作 ELISA 中载体的物质很 ，最常用的是聚苯乙烯。聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白质抗原吸附其上后保留原来的免疫活性。聚苯乙烯为塑料，可制成各 形式。在 ELISA 测定过程中，它作为载体和容器，不参与化学反应。加之它的价格低廉，所以被普遍采用。ELISA 载体的形状主要
8、有三种：小试管、小珠和微量反应板。小试管的特点是还能兼作反应的容器，最后放入分光光度计中比色。小珠一般为直径 0.6cm 的圆球，表面经磨砂处理后吸附面积 增加。如用特殊的洗涤器，在洗涤过程中使圆珠滚动淋洗，效果 好。最常用的载体为微量反应板，专用于 ELISA 测定的产品也称为 ELISA 板，国际通用的标准板形是 812 的 96 孔式。为便于作少量标本的检测，有制成 8 联或 12 联孔条的，放入座架后，大小与标准 ELISA板相同。ELISA 板的特点是可以同时进行大量标本的检测，并可在特定的比色计上迅速读出结果。现在已有多种自动化仪器用于微量反应板型的 ELISA 检测，包括加样、洗
9、涤、保温、比色等步骤，对操作的标准化极为有利。良好的 ELISA 板应该是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之间和同一板各孔之间性能相近。聚苯乙烯 ELISA 板由于配料的不同和制作工艺的差别，各种产品的质量差异很大。因此每一批号的聚苯乙烯制品在使用 须检查其性能。常用的检查方法为：以一定浓度的人 IgG（一般为 10ng/ml）包被 ELISA 板各孔后，每孔内加入适当稀释的酶标抗人 IgG 抗人 IgG 抗体，保温后洗涤，加底物显色，终止酶反应后分别测每孔溶液的吸光度。控制反应条件，使各读 在 0.8 左右。计算所有读数的平均值。所有单个读数与平均读数之差应小于10。与聚苯乙烯类似的
10、塑料为聚氯乙烯。作为 ELISA 固相载体，聚氯乙烯板的特点为质软板薄，可切割，价廉、但光洁度不如聚苯乙烯板。聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值有时也略高。为比较不同固相在某一 ELISA 测定中的优劣，可用以下方法加以检验：用其它免疫学测定方法选出一个典型的阳性标本和一个典型的阴性标本。将它们分别进行一系列稀释后，在不同的固相载体上按预定的 ELISA 操作步骤进行测定，然后比较测定结果。在哪一种载体上阳性结果与阴性结果判别最大，这种载体就是这一 ELISA 测定的最合适的固相载体。除塑料制品外，固相酶免疫测定的载体还有两种材料：一是微孔滤膜，如硝酸纤维素膜、尼龙膜等，这类测定
11、形式将在本章第五节“膜载体的酶免疫测定”中介绍。另一种载体是以含铁的磁性微粒制作的，反应时固相微粒悬浮在溶液中，具有液相反应的速率，反应结束后用磁铁吸引作为分离的手段，洗涤也十分方便，但需配备特殊的仪器。（二）抗原和抗体在 ELISA 实施过程中，抗原和抗体的质量是实验是否成功的关键因素。本法要求所用抗原纯度高，抗体效价高、亲和力强。ELISA 所用抗原有三个来源：天然抗原、重组抗原和合成多肽抗原。天然抗原取材于动物组织或体液、微生物培养物等，一般含有多种抗原成分，需经纯化，提取出特定的抗原成分后才可应用，因此也称提纯抗原（purifiedantigen）。重组抗原（recombinantan
12、tigen）和多肽抗原（peptideantigen ）均为人工合成品，使用安全，而且纯度高，干扰物质少。因此虽然制备合成抗原有较高的技术难度且要求较为昂贵的仪器设备和试剂，其应用仍十分普遍，特别是对那些天然抗原不易得到的试验，更显出其独到之处。用于 ELISA 的抗体有多克隆的和单克隆的。抗血清成分复杂，应从中提取 IgG 才可用于包被固相或酶标记。含单克隆抗体的小鼠腹水中的特异性抗体含量较高，有时可适当稀释后直接进行包被。制备酶结合物用的抗体的质量往往要求有较高的纯度。经硫酸铵盐析纯化的 IgG 可进一步用各种分子筛层析提纯。也可用亲和层析法提纯特异性 IgG，如用酶消化 IgG 后提取的
13、 Fab 片段，则效果更好。（三）免疫吸附剂固相的抗原或抗体称为免疫吸附剂。将抗原或抗体固相化的过程称为包被（coating）。由于载体的不同，包被的方法也不同。如以聚苯乙烯 ELISA 板为载体，通常将抗原或抗体溶于缓冲液（最常用的为 pH9.6 的碳酸缓冲液）中，加于 ELISA 板孔中在 4过夜，经清洗后即可应用。如果包被液中的蛋白质浓度过低，固相载体表面有能被此蛋白质完全覆盖，其后加入的血清标本和酶结合物中的蛋白质也会部分地吸附于固相载体表面，最后产生非特异性显色而导致本底偏高。在这种情况下，如在包被后再用 15 牛血清白蛋白包被一次，可以消除这种干扰。这一过程称为封闭（blockin
14、g）。包被好的 ELISA 板在低温可放置一段时间而不失去其免疫活性。（四）酶和底物ELISA 中所用的酶要求纯度高、催化反应的转化率高、专一性强、性质稳定、来源丰富、价格不贵、制备成的酶标抗体或抗原性质稳定，继续保留着它的活性部分和催化能力。最好在受检标本中不存在与标记酶相同的酶。另外它的相应底物应易于制备和保存，价格低廉，有色产物易于测定，光吸收高。ELISA 中最常用的酶为辣根过氧化酶（HRP）和从牛肠粘膜或大肠杆菌提取的碱性磷酸酶（AP）。HRP 在蔬菜作物 辣根中含量很高，纯化方法也不复杂。它是一种糖蛋白，含糖量约 18；分子量为 44kD；是一种复合酶，由主酶（酶蛋白）和辅基（亚铁
15、血红素）结合而成的一种卟啉蛋白质。主酶为无色糖蛋白，在 275nm 波长处有最高吸收峰；辅基是深棕色的含铁卟啉环，在 403nm 波长处有最高吸收峰。HRP 催化下列反应：上式中 DH2 为供氢体，H 2O2O 为受氢体。HRP 对受氢体的专一性很高，除H2O2 外，仅 作用于小分 子醇的过氧化物和尿素的过氧化物。后者为固体，作为试剂较 H2O2 方便。许多 化合物可作为 HRP 的供氧体，在 ELISA 中常用的供氢体底物为邻苯二胺（orthopenylenediamine，OPD ）、四甲基联苯胺（3，3 ，5，5-tetramethylbenzidine ，TMB）和 ABTS2，2 -
16、azino-bis(3-ethyl-benzthiazolinesulfonate-6)。OPD 为在 ELISA 中应用最多的底物，灵敏度高，比色方便。其缺点是配成应用液后稳定性差，而且具有致异变性。TMB 无此缺点。TMB 经酶作用后由无色变蓝色，目测对比鲜明；加酸停止酶反应后变黄色，可在比色计中定量；因此应用日见增多。ABTS，虽然灵敏度不如 OPD 和 TMB，但空白值很低。HRP催化 OPD 的反应如下：HRP 的纯度用 RZ（ReinheitZahl ，意为纯度数）表示，是 403nm 的吸光度与 280nm 的吸光度之比，高纯度的 HRP 的 RZ3.0。应注意的是酶变性后，RZ 可不变而活力降低，故重用酶制剂时更重要的指标为活力。酶活力以单位表示：1min 将 1mol 的底物转化为产物的酶量为 1 个单位。在 ELISA 中另一常用的酶为碱性磷酸酶。从大肠
