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1、1经皮附睾穿刺取精术结合单精子卵细胞质内显微注射技术治疗梗阻性无精子症作者：罗亚宁，张顺，李丽，周婷，黄剑磊，王晓红 【摘要 】 目的： 探讨经皮附睾穿刺取精子术（PESA）结合单精子卵细胞浆内显微注射技术（ICSI）治疗梗阻性无精子症的临床效果. 方法： 根据精子来源和精液质量参数分为 3 组.梗阻性无精子症患者 44 个周期采用 PESA 获得精子，女方进行常规促排卵并获得成熟卵细胞后，用 ICSI 技术进行受精(A 组) ；同期严重少弱畸精症患者 75 个周期(B 组); 少弱精症患者 45 个周期(C 组). 比较 3 组的受精率、卵裂率、优质胚胎率、临床妊娠率和胚胎种植率. 结果：
2、3组比较 5 项统计结果均无统计学差异 . 结论： 附睾穿刺取到的精子和体外排出的精子具有相同的受精和获得优质胚胎的能力，采用PESA 结合 ICSI 技术是治疗梗阻性无精子症的安全有效方法 . 【关键词】 经皮附睾穿刺吸取精术；精子注射,细胞质内；少精子症；不育,男( 雄)性0 引言2梗阻性无精子症占男性不育的 5%15%，是男科领域的一个难题. 以前这类患者缺乏有效的治疗手段. 直到近十余年来 ICSI 技术的出现和发展，才使梗阻性无精子症患者有机会生育自己的后代. 对于严重男性因素的不育患者，通过 ICSI (intracytoplasmic sperm injection)技术获得后代
3、的机会，要远大于除供精人工受精以外的其他治疗措施1. 我们采用 PESA(percutaneous epididymal sperm aspiration)取精方法结合 ICSI 技术治疗梗阻性无精子症，取得了很好的疗效.1 对象和方法1.1 对象 200405/200707 在我中心接受 ICSI 技术助孕治疗的 164 个周期，根据精子来源和精液质量参数分为 3 组： 男方采用经皮附睾穿刺吸取少量精子的无精子症患者 44 个周期作为 A 组（PESA 组） ，同期严重少弱畸精症患者 75 个周期作为 B 组，轻度少弱畸精症患者 45 个周期作为 C 组. 入选 PESA 组的患者符合如下条
4、件： 至少 2 次射出精液经离心后未见精子； 双侧睾丸总体积30 mL； 血清 FSH 值在正常范围； 睾丸活检结果提示曲细精管内可见各级生精细胞及成熟精子； 染色体核型分析及 Y染色体微缺失筛查结果均正常.3 组的女方均为原发性不孕症，辅助生殖前相关检查未见异常.31.2 方法1.2.1 促超排卵及卵母细胞收集及处理按文献2的方法进行.1.2.2 精子获取和精液处理 PESA 组常规消毒外生殖器，20 g/L盐酸利多卡因封闭精索及局部麻醉阴囊皮肤，将附睾固定于阴囊皮下，用 1 mL 注射器接 16 G 套管针并吸取 0.2 mL 精子处理液，经皮刺进附睾头部，持续低负压抽吸附睾液，直至取得略
5、浑浊的附睾液为止. 将吸出的液体滴入培养皿并在显微镜下观察. 见活动精子后停止取精，将收集到的精子经微 Isolate 梯度法处理或直接洗涤后备用. 冷冻保存时将取到的附睾液和等量的冷冻保护剂充分混匀，将混合液分装入冻存管中. 程序冷冻后置于液氮罐保存.解冻时先置于37水浴，完全解冻后再行精液处理. B 组和 C 组手淫取精，采用上游法或 Isolate 梯度法处理精液.1.2.3 显微操作显微操作在 NIKON TE300 配 Hoffman 调制反差光学系统、Eppendorff 显微操作系统下放大 200 倍条件下进行. 选择活动力强、形态正常的精子用注射针按压精子尾部直至其失去活动力，
6、将 1 条制动后的精子吸入注射针 . 选择 M期卵母细胞用固定针固定在第一极体位于 12 点钟或 6 点钟位置上，将吸入制动精子的注射针从卵母细胞 3 点钟方向刺入，回吸少量卵浆，卵膜破裂后，将精子注入卵浆内.41.2.4 胚胎培养及胚胎移植注射后 1620 h 在倒置显微镜下观察受精情况. 有雌、雄原核和第一、第二极体者为正常受精的合子，正常受精的合子继续置于 37，50 mL/L CO2 培养箱培养. 取卵后4872 h，选择质量优良的 23 个胚胎移植入子宫腔. 其余符合冷冻条件的胚胎冷冻保存.1.2.5 黄体支持和监测胚胎移植后，用 HCG 或黄体酮维持黄体功能，于移植后 15 d 查
7、尿或血 HCG，若阳性则于停经 7 wk 行 B 超检查，见孕囊及原始心管搏动诊断为临床妊娠，继续随访至妊娠结束.统计学处理： 采用 SPSS10.0 软件对数据进行处理，行方差分析和 2 检验.2 结果2.1 患者一般情况共治疗 164 个周期，取到 1835 个卵子，平均每周期取卵数为 11.2 个. 在 PESA 组 37 个周期患者采用附睾穿刺吸取的新鲜精子，7 个周期采用经冻融的附睾精子；严重少弱畸精症患者和轻度少弱畸精症患者均采用手淫取到的新鲜精子. 3 组患者在女方年龄、不孕时间、促超排卵（COH）天数、Gn 用量、注射hCG 日 E2 值、注射 hCG 日子宫内膜厚度、平均 M
8、卵数、平均5受精数、平均胚胎数、平均优质胚胎数、平均移植胚胎数等方面比较均无统计学差异(P0.05). 在平均取卵数上 PESA 组和其他两组相比有统计学差异(P0.05). 表 2 临床结局比较3 讨论1992 年世界首例 ICSI“试管婴儿”诞生，自此彻底改变了男性不育症的治疗策略，成为治疗多种男性不育症的主要手段，是男性不育治疗新的里程碑3. ICSI 技术使精卵细胞无需经历复杂的受精过程，直接将精子注入卵细胞内，形成受精胚胎. 该技术对精子数量、活力、受精能力的要求极低，是治疗包括梗阻性无精子症在内的男性因素所致配子传递障碍的有效手段. 此外，对于部分非梗阻性无精子症患者，可以先通过
9、MESA 或 TESE 手术获得精子；部分重度畸形精子症的患者，可以在显微镜下选择形态活力正常的精子，最后通过 ICSI 技术达到受精的目的.6不同来源和参数的精子对 ICSI 结局是否产生影响目前尚无定论. 多数的文献报道4-5显示，只要有活的精子，ICSI 技术就可以克服与受精失败相关的精子形态的、活动力的和其他方面的缺陷，使自然情况下不能穿过透明带的、活动力差的精子获得受精、卵裂及妊娠6. 我们的研究结果显示： 附睾精子与轻度少弱畸精和严重少弱精子相比，3 组的受精率、优质胚胎率、临床妊娠率和胚胎种植率均无统计学差异.精子在睾丸中产生，在附睾中贮存并进一步成熟，获得运动能力、识别卵子透明
10、带的能力以及与卵子结合的能力. 在某些先天性或者获得性因素作用下，引起精道梗阻，导致男性配子传递障碍，即梗阻性无精子症. 通过 PESA 技术可以获得成熟的精子，是解决梗阻性无精子症患者精子来源问题的重要方法. 我中心采用 18 G 套管针穿刺附睾，针尖所在位置手指可触及，穿刺位置及深度明确可靠，刺破的附睾小管数量较多，获取的精子数量相对较多，避免了反复穿刺所造成的过度损伤，操作时间短，患者痛苦小，可以获得足量高质量的精子. 另外，由于 PESA 有一定的创伤性，并且再次穿刺有失败的可能性，所以我们在行 ICSI 操作之前，常规进行诊断性附睾穿刺取精子术，在事先明确患者有精子并予以冷冻保存的情
11、况下，才安排女方进入促排卵周期，从而最大程度上降低了再次附睾穿刺失败的风险.7ICSI 在临床上的成功应用为男性不育的治疗提供了一种有效手段. 但同时我们必须认识到，大约 10%13%的无精子症是由于染色体或基因的异常引起的7. ICSI 技术在使这些患者实现当父亲的愿望的同时，也增加了将异常的遗传信息传递给子代的风险. 因而在行 ICSI 助孕治疗之前对男性患者进行遗传学筛查和咨询是十分必要的. 我们对 PESA 组患者在行 ICSI 之前均进行了染色体核型分析以及 Y 染色体微缺失筛查，结果无异常发现.总之，我们的研究结果表明，采用 PESA 结合 ICSI 技术可以有效地帮助梗阻性无精子
12、症获得临床妊娠. 但就其远期影响，特别是对通过此方式出生的个体的远期影响，仍需足够长的时间和足够多的样本数予以说明.【参考文献】 1 ESHRE Capri Workshop Group. Intracytoplasmic sperm injection (ICSI) in 2006: Evidence and EvolutionJ. Hum Reprod Update, 2007, 13(6):515-526.2 王晓红，罗亚宁，姚元庆. 卵母细胞浆内单精子显微注射技术的临床应用J. 陕西医学杂志, 2005, 33(11): 977.3 Palermo G, Joris H, Devroe
13、y P, et al. Pregnancy after 8intracytoplasmic injection of a single spermatozoon into an oocyteJ. Lancet, 1992, 340(8810):17-18.4 李满，庄广伦，李蓉，等. 用射出精子、附睾精子、睾丸精子显徽授精治疗男性不育J. 中华外科杂志 , 2000, 38(4): 280-282.5 Sukcharoen N, Sithipravej T, Promviengchai S, et al. Comparison of the fertilization rate after i
14、ntracytoplasmic sperm injection (ICSI) using ejaculated sperms, epididymal sperms and testicular spermsJ . J Med Assoc Thai, 1998, 81(8):565-571.6 Nagy ZP, Liu J, Joris H, et al. The result of intracytoplasmic sperm injection is not related to any of the three basic sperm parametersJ. Hum Reprod, 1995, 10(5)：1123-1129.7 SchlegelPN, PalermoGD, GoldsteinM, et al. Testicular seprmextraction with ICSI for nonobstructive azoospermiaJ. Urology, 1997, 49(3):435-440.
