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1、1细胞色素 P450 3A4 抗原表位的分析及其抗体的制备与鉴定作者：刘海英, 杨微, 武正华, 唐晓波, 朱大岭【关键词】 CYP3A4;,合成肽;,多克隆抗体 ,摘 要 目的: 制备兔抗人细胞色素 P450 3A4（CYP3A4）抗体及其特性鉴定。方法: 利用生物信息学方法分析 CYP3A4 蛋白的序列, 根据亲水性、 抗原性、 柔韧性及表面性等指标选择多肽序列, 合成 CYP3A4 多肽, 与载体蛋白钥孔戚血蓝素（KLH）偶联, 免疫日本大耳白兔制备抗 CYP3A4 抗体。辛酸硫酸铵法纯化抗体, 间接 ELISA 测定抗体的效价及相对亲和力常数, Western blot 鉴定其特异性,
2、 免疫组化进行定位。结果: 获得针对小分子 CYP3A4 的抗体。该抗体效价为 116000; 相对亲和力常数在 105106 M-1, 具有实用价值; 可与 CYP3A4 合成肽及天然 CYP3A4 出现特异性反应; 可识别正常人肝脏组织 CYP3A4; Western blot 的结果显示, 该抗体识别的相应抗原的相对分子质量（Mr）为 46000。结论: 合成的多肽 KLH 复合物具有免疫原性, 可用于制备相应的抗体。制备的兔抗 CYP3A4 合成肽抗体可应用于 ELISA、 Western blot 和免疫组化实验。2关键词CYP3A4; 合成肽; 多克隆抗体 细胞色素 3A4(CYP
3、3A4)是细胞色素 P450 超家族成员之一, 主要存在于肝脏中、 小肠中。它是人类药物代谢酶中的最重要的酶, 在临床上超过半数的药物完全或部分地被该酶代谢1。CYP3A4 与外源性致癌物、 抗癌药物和内源性类固醇激素、 维生素、 脂肪酸的代谢转化密切相关2, 3。目前, 国外已研制出抗 CYP3A4 的抗体并且应用试验中; 而国内在研制 CYP450 抗体领域属于空白阶段, 我们研制出针对 278-292 位的抗人 CYP3A4 抗体, 并将对 CYP3A4功能的研究、 体外药物代谢及对其基因表达调控的肿瘤防治提供新的思路。1 材料和方法1.1 材料 日本大耳白兔, 雄性, 6 周龄, 由哈
4、尔滨医科大学动物实验中心提供。福氏佐剂及 3,3,5,5 四甲基联苯胺（TMB ）均购自 Sigma 公司。 HRP 山羊抗兔 IgG 购自 Jackson ImmunoResearch 公司。牛血清白蛋白（BSA）购自 Solarbio 公司。硝酸纤维素膜（NC）购自 BIORAD 公司。 ECL Plus 购自Amersham Biosciences 公司。即用型 SABC 免疫组化试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。其他试剂均为国产分析纯。多肽合成及其与 KLH、 BSA 的联接由北京中科亚光生物有限公司完成。3正常人肝脏组织, 由“人类肝脏蛋白质组计划”项目提供。 1.2 方法 1.
5、2.1 CYP3A4 抗原表位的分析 由 SWISS PROT 网站获知CYP3A4 蛋白的序列, 然后利用 DNAStar 软件分析其序列的特点, 确定 278-292 位 15 个氨基酸作为欲合成的多肽序列: SQNSKETESHKALSD。1.2.2 CYP3A4 多肽的合成及其与 KLH 和 BSA 的交联 CYP3A4 多肽由北京中科亚光生物有限公司合成; 获得的多肽经常规 C18 的 RP2HPLC 柱进行纯化, 纯度达 95%。CYP3A4 与 KLH和 BSA 的交联采用戊二醛连接法, 将 5 mg 合成多肽分别加入 7 mg KLH 和 BSA 中, 边振荡边缓慢加入新鲜配制
6、的 3 g/L 的戊二醛溶液（1 mL）, 室温作用 2 h。以 pH8.5 硼酸缓冲液透析过夜, 交联成 CYP3A4KLH、 CYP3A4BSA 偶联物。1.2.3 兔抗 CYP3A4 多肽抗体的制备 每只取 200 g 多肽KLH 偶联物与等量的完全福氏佐剂充分乳化后, 于兔背部皮下多点注射, 每点约 100 g。2 周后加强免疫, 剂量同前, 用不完全福氏佐剂充分乳化后, 于兔背部皮下多点注射; 以后隔 2 周加强 1 次; 从第 3 次加强免疫开始, 每次免疫后 7 d, 经耳缘静脉采血测定抗体的4效价4, 5。经 4 次加强免疫后, 符合要求, 立即颈动脉取血。分离血清后, 无菌分
7、装保存于-80备用。1.2.4 人肝脏微粒体蛋白制备 取 10 g 正常人的肝脏、 剪碎, 用磷酸钾盐缓冲液反复冲洗除去血红蛋白后, 加入上述磷酸钾盐缓冲液制成肝匀浆。然后将肝匀浆依次于 4以 10000 g 离心 30 min, 取上清液, 以 30000 g 离心 60 min, 取上清液及 100000 g离心 60 min, 取沉淀后 , 悬浮于磷酸钾盐缓冲液（含有 200 mL/L甘油, 5 g/L 胆酸钠, 2 mg/L 抑肽酶, 2 mg/L 亮肽素, 1 mg/L 胃酶抑素及 1 mmol/L 苯甲基磺酰氟）中, 用 Bradford 法进行蛋白定量。分装后, 置于 -80冰箱
8、内贮存备用。1.2.5 抗血清的纯化 用醋酸钠缓冲液（60 mmol/L, pH=4.0）将抗血清稀释 34 倍, 0.1 mol/L NaOH 调节 pH 至 4.5, 缓慢滴加辛酸至浓度为 25 mL/L, 室温搅拌 30 min。4 10000 g离心 30 min, 弃沉淀后滤膜（0.22 m）过滤, 加入 1/10 体积的10PBS, 用 0.1 mol/L NaOH 调节 pH 至 7.4, 缓慢加入预冷的饱和硫酸铵至 45%饱和度, 混合后 4过夜。4 3000 g 离心 30 min, 弃上清后, 用 0.01 mol/L PBS（pH=7.4）重悬, 透析过夜。用 Branf
9、ord 法进行蛋白定量。经 SDSPAGE 分离后, 用 BIORAD quantity one 软件分析其纯度。51.2.6 ELISA 检测抗血清效价 ELISA 检测板用以多肽 BSA 偶联物以 1 mg/L 的浓度包被, 每孔 100 L, 4 孵育过夜后, 用 10 mL/L 的牛血清封闭, 每孔 200 L, 37 2 h 后, 洗涤备用。取出包被好的检测板, 每孔加入按 12 梯度稀释的抗血清 100 L (对照为正常兔血清) , 37孵育 30 min, 洗涤 3 次后每孔加入 1 5000 稀释的 HRP 标记的羊抗兔 IgG 100 L, 37孵育 15 min, 洗涤 3
10、 次后进行 TMB 显色, 37孵育 15 min, 终止反应后, 用酶标仪式测定样品 A450 值.1.2.7 间接 ELISA 检测抗血清亲和常数 ELISA 检测板分别用多肽交联 BSA 包被成 5 mg/L 和 10 mg/L, 封闭后加入倍比稀释的已知蛋白浓度的纯化后的多抗, 再加入 HRP 标记的羊抗兔 IgG 二抗, TMB 显色测定 A450。以抗体浓度的对数为横坐标, A 值为纵坐标作图。以曲线达到水平的 A 值为 100%, 求出 A50 即 50%A 值时对应的抗体浓度.按照 Kaf f=(n1)/2(nAb t2Abt) 算出抗体亲和常数, 其中Abt 、 Abt 指的
11、是 A50 时即包被分别 5 mg/L 和 10 mg/L 时抗体半饱和时抗体的摩尔浓度, Agt, Agt指的是包被的抗原浓度本实验中即指 10 g 和 5 g, n=Agt/Agt, 本实验中 n=26。1.2.8 多克隆抗体的 Western blot 分析 用 2SDS 上样缓冲液悬浮制备的人肝脏微粒体蛋白、 多肽 BSA 及 BSA, 于 95 加热 5 min, 置于冰上冷却 10 min。上样量分别为 70、 15 和 15 g, 6经 SDSPAGE 分离后, 以湿转法电转至硝酸纤维素膜上。经脱脂奶粉封闭（室温 1 h）后, 依次滴加 11000 稀释抗血清（4过夜, 以 1
12、mL/L Tween20 TBS 洗膜 3 次）及 110000 HRP 山羊抗兔IgG（室温孵育 1 h, 以 1 mL/L Tween20 TBS 洗膜 3 次） 。用化学发光剂试剂盒（ECL Plus）处理 5 min 后, 于暗室曝光到 X 胶片上显影、 定影。1.2.9 多克隆抗体的免疫组化染色 取出用丙酮固定的冰冻人正常肝脏组织切片, 滴加 50 g/L BSA, 室温下封闭 20 min, 加入11000 稀释兔抗人 CYP3A4 多肽抗体, 4孵育过夜。PBS 洗片后加入羊抗兔 IgGHRP, 37 孵育 20 min, PBS 洗片后进行 DAB 显色, 苏木素复染, 返蓝后
13、, 脱水、 透明、 封片, 镜检, 放大 400 倍拍照记录结果7。2 结果2.1 CYP3A4 的氨基酸序列分析 用 DNAStar 软件对蛋白序列进行分析（图 1）, 根据亲水性、 抗原性、 表面性及柔韧性 4 个参数预测的结果进行综合考虑, 选取欲合成的多肽序列为 278-292位氨基酸（图中阴影区）: SQNSKETESHKALSD。图 1 DNAstar 软件对人 CYP3A4 蛋白序列参数的预测略72.2 CYP3A4 合成肽抗原的合成与纯化 化学合成的多肽经HPLC 纯化后, 纯度可达 95%, 交联 KLH 后可作为抗原免疫动物。2.3 抗血清的特性鉴定 效价测定: 间接 EL
14、ISA 法检测表明, 抗血清的效价为 116000。相对亲和力常数测定: 纯化抗血清按12 的蛋白浓度倍比稀释, 绘制标准曲线如图 2 所示, 结果表明相对亲和力常数在 105106 M-1。抗体特异性鉴定: 以制备的人肝脏微粒体蛋白、 多肽 BSA、 BSA 作为抗原, 以兔抗血清作为一抗进行 Western blot 分析显示, 抗血清与人肝脏微粒体蛋白在 Mr约为 46000 处出现 1 条清晰带, 与 CYP3A4 Mr 相符; 与多肽 BSA在 Mr 约为 69000 处出现 1 条清晰带, 与 BSA Mr 相符; 而与 BSA则无条带出现（图 3） 。说明所制备的抗体可识别含有半
15、抗原的抗原表位的蛋白并能与天然 CYP3A4 蛋白结合。图 2图 3 略2.4 兔抗人 CYP3A4 多克隆抗体的免疫组化定位 CYP3A4主要分布在内质网和线粒体内膜, 而二者位于胞质中。经免疫组化实验证明, CYP3A4 多肽多克隆抗体可与正常人肝细胞胞质中的CYP3A4 蛋白结合（图 4） 。8图 4 兔抗人 CYP3A4 多克隆抗体的免疫组化定位分析 略3 讨论国外 Abcam、 Researchd、 Cypex 公司已研制出用于ELISA、 Western blot 和免疫组化的抗 CYP3A4 抗体, 但上述公司抗体仅能应用部分试验。而本实验室的抗 CYP3A4 抗体可完全用于以上
16、试验。表位是抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团, 找到一个抗原的表位, 就可能研制出针对该抗原的抗体或疫苗。结合现代生物信息学,用多参数的综合预测抗原表位可以提高预测的准确性8。本实验中进行蛋白质序列表位分析时, 着重考虑了以下几个方面9: 亲水性高。疏水性片段往往为跨膜成分或嵌入膜成分; 而亲水性片段多暴露在脂质双分子膜外, 容易形成抗原识别位点。表面可及性强。柔韧性好, 更易形成三维结构, 暴露抗原表位。连续性表位的氨基酸残基数在 1020 之间为宜, 过短时不易形成明显的表位, 过长则合成时发生错误的机会增加。根据以上原因最终确定以亲水性强、 抗原指数高、 表面性及柔韧性好的区域（即278-292 位 14 个氨基酸）作为 CYP3A4 的抗原决定簇。虽然合成肽与载体蛋
