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1、1细胞周期相关蛋白在肝癌细胞系 HCC9204表达的免疫细胞化学定位作者：杨连君王文亮司晓辉 【关键词】 细胞周期相关蛋白 关键词: 细胞周期相关蛋白;肝细胞癌;免疫细胞化学 0 引言 肿瘤细胞的发生和增殖与细胞周期蛋白（Cyclin）及其相关分子 Cyclin 依赖性蛋白激酶（CDK）和 CDK 抑制蛋白（CKI）的调控密切相关1 .关于 Cyclin 及其调控分子在培养的原发性肝细胞癌（以下简称肝癌）细胞中表达的定位情况尚未见报道.我们采用免疫细胞化学技术检测 Cyclin D1 及其相关分子 CDK4 和 CKI 家族中的 p27Kip1 在培养的肝癌细胞系 HCC-9204 中的表达情
2、况. 1 材料和方法 1.1 细胞来源 人肝癌细胞系 HCC-9204 和对照用的正常人肝细胞系 QZG 为本室保存.于含盖玻片的 6 孔板内用含100mLL-1 新生牛血清的 RPMI1640 培养液培养.待细胞生长至单层时，取出玻片，PBS 缓冲液洗，950mLL-1 乙醇固定 15min，再用 PBS 洗后 4备用. 21.2 主要试剂 鼠抗人 Cyclin D1，CDK4 和 p27Kip1mAb均为美国 Santa Cruz 公司产品.DAB 为美国 Sigma 公司产品.免疫组化 ABC 试剂盒为美国 Vector 公司产品. 1.3 染色方法 细胞片入 7.5mLL-1 H2 O
3、2 内，37，10min;加正常羊血清，37，30min;分别加鼠抗人Cyclin D1，CDK4 或 p27Kip1mAb，以 PBS 作为阴性对照，4过夜; 加生物素化羊抗鼠 IgG，37，30min; 加 ABC 复合物，37，30min.上述各步间均用 PBS 洗;DAB 显色后脱水，透明，封片. 1.4 结果判断 阳性信号为棕黄色 .每个细胞片随机选取不相重叠的视野，计数 300 个细胞，观察其是否为阳性及其染色部位. 2 结果 Cyclin D1，CDK4 和 p27Kip1 在 HCC-9204 细胞表达的阳性率及其定位情况见表 1、图 1 和图 2.与在 HCC-9204 细胞
4、中的表达情况相比，QZG 细胞中的 Cyclin D1 和 CDK4 相对较弱，而p27Kip1 相对较强.所有阴性对照中均为阴性. 表 1 Cyclin D1，CDK4 和 p27Kip1 在 HCC-9204 细胞表达的阳性率和定位情况略 3图 1 略 3 讨论 细胞周期的内源性调控主要是通过 Cyclin-CDK-CKI 进行网络调控来实现的.Cyclin 和 CKI 分别对 CDK 进行正反调控.Cyclin D1 是 Cyclin 中与细胞周期 G1 期密切相关的主要类型，在正常组织中表达水平低.近年来发现，Cy-clin D1 在多种肿瘤组织中呈异常的高表达2，3 .CDK4 是
5、CDK 家族中的主要类型.p27Kip1 是近年来新发现的一种 CKI，对细胞 G1 期限制点具有重要的调控作用.p27Kip1 蛋白水平在静止期细胞中较高，在多种肿瘤组织中呈异常的低表达4 .在我们的研究中，肝癌细胞中的 Cyclin D1 和CDK4 强于正常肝细胞对照，而 p27Kip1 相对较弱，与上述观点一致. 以往报道多认为 Cyclin D1 表达主要为细胞核阳性2 .我们观察到 HCC-9204 细胞主要为细胞质染色.说明虽然肝癌细胞中的Cyclin D1 与 CDK 相互作用是细胞核事件，CyclinD1 也可能分布并贮存于细胞质.本研究表明，肝癌细胞的 p27Kip1 表达
6、主要为细胞质阳性，CDK4 主要为细胞核阳性，与以往的报道一致4 . Cyclin D1 与 CDK4 结合后促进 RB 蛋白的磷酸化，从而解除 RB 对核转录因子 E2F 的抑制效应，启动 DNA 的合成，加快细胞由 G1 期向 S 期的过渡 1 .p27Kip1 对上述过程起负调控作用.4因此，Cyclin D1 的过量表达或 p27Kip1 的低表达可导致细胞的G1 期缩短，从而促进肿瘤细胞的恶性转化.我们的研究表明，Cyclin D1，CDK4 和 p27Kip1 在 HCC-9204 细胞都有一定程度的表达，为采用 HCC-9204 细胞进行肝癌的细胞周期蛋白及其相关分子的研究奠定了
7、基础. 参考文献: 1Grana X，Reddy EP.Cell cycle control in mammalian cells:Role of cyclins，cyclin dependent kinases（CDKs） ，growth sup-pressor genes and cyclin-dependent kinase inhibitors（CKIs） J.Oncogene，1995;11（2）:211-219. 2Bartkova J，Lukas J，Muller H et al.Cyclin D1protein expres-sion and function in human
8、 breast cancer J.Int J Cancer，1994;57（3）:353-361. 3Nishida N，Fukuda Y，Komeda T et al.Amplification and over-expression of cyclin D1gene in aggressive human hepatocelluar carcinoma J .Cancer Res，1994;54（12 ）:3107-3110. 4Anayama T，Furihata M，Ishikawa T et al.Positive correlation between p27Kip1expression and progression of human esophageal squamous cell carcinoma J.Int J 5Cancer，1998;79（4）:439-443.
