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1、1糖尿病肾病病人醛糖还原酶基因多态性相关研究【摘要】 目的 探讨醛糖还原酶 (AR) 基因 5端(AC)n 多态性与 2 型糖尿病肾病的关系。方法 采用聚合酶链反应(PCR)、聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染色技术分析了 139 例 2 型糖尿病病人(早期糖尿病肾病组 61 例,非糖尿病肾病组 78 例) 和 63 例正常对照者 AR 基因 5 端(AC)n 的多态性。结果 早期糖尿病肾病组 Z-2 等位基因频率高于非糖尿病肾病组和正常对照组(2 = 6.88、10.51，P0.01)；含 Z-2 等位基因的基因型频率也高于非糖尿病肾病组和正常对照组(2=4.95、8.15，P0. 05、0.01)。
2、结论 AR 基因 Z-2 等位基因与青岛地区汉族 2 型糖尿病病人糖尿病肾病的发生发展有关。 【关键词】 糖尿病肾病 醛还原酶 基因型 基因频率 ABSTRACT ObjectiveTo investigate the association between (AC)n polymorphisms at 5end of the aldose reductase gene and diabetic nephropathy of Type 2 diabetes mellitus.MethodsThe 5ALR polymorphism in 139 patients with Type 2 dia
3、betes (61 cases with nephropathy, 78 without nephropathy) and 63 healthy controls was identified in genomic DNA using polymerase chain reaction and PAGE gel electrophoresis together with silverstaining.ResultsThe frequency of allele Z-2 was significantly higher in patients 2with diabetic nephropathy
4、 compared with that of without nephrophaty and controls (2 = 6.88,10.51;P0.01). The genotypic frequency of allele Z-2 was significantly higher in those with diabetic nephropathy compared with that of without nephrophaty and controls (2 =4.95,8.15;P0.05,0.01).ConclusionAllele Z-2 of aldose reductase
5、may contribute to the pathogenesis of diabetic nephropathy with type 2 diabetes mellitus. KEY WORDS diabetic nephropathies; aldose reductase; geneotype; gene frequency 糖尿病肾病(DN) 是糖尿病常见的慢性微血管并发症之一, 大约30%40%的糖尿病病人发生 DN, DN 已成为终末期肾衰竭的主要原因之一。研究显示，糖代谢的多元醇通路与 DN 等慢性微血管并发症密切相关。而醛糖还原酶(AR) 是多元醇通路的限速酶, 该基因表达异
6、常或酶活性改变,将促进 DM 微血管并发症的发生。近几年国内外学者研究显示，AR 基因 5端转录起始点上游 2.1 kb 处存在(AC)n 重复序列多态标记,该标记与 DN 的发生有密切关系。本研究旨在探讨青岛地区汉族 2 型糖尿病病人 AR 基因 5端的(AC)n 多态性与糖尿病肾病的关系。 1 对象和方法 1.1 研究对象 1.1.1 2 型糖尿病组 青岛大学医学院附属医院内分泌科住院及门3诊青岛地区汉族 2 型糖尿病病人 139 例, 病程 10 年以上。病人均符合 1999 年 WHO 糖尿病诊断和分类标准。根据 24 h 尿微量白蛋白排泄率(UAER)分为 2 组:早期 DN 组:6
7、1 例, 男 24 例，女 37 例,年龄 4977 岁，平均（63.897.82) 岁,病程为 (13.94.1)年;入选标准为 6 个月内 UAER 连续 2 次为 20 200 g/min,且血清肌酐(SCr)120 mol/L,并排除由心、肝和其他全身疾病或原发泌尿系统疾病及应用影响肾功能药物引起微量白蛋白尿者。非糖尿病肾病（NODN ）组:本组 78 例, 男 30 例，女 48 例,年龄为 4878岁，平均（64.136.58）岁, 病程为(13.33.7)年；即糖尿病病人 6个月内 UAER 连续 2 次均20 g/min,SCr120 mol/L 者。 1.1.2 正常对照(C
8、ON)组 共 63 例, 男 24 例，女 39 例,年龄5078 岁，平均（64.117.21) 岁；为青岛大学医学院附属医院健康体检成年人,经检查排除糖尿病、冠心病、高血压、高脂血症、肾脏疾病等，均无疾病家族史。 1.2 实验方法 1.2.1 提取外周血白细胞基因组 DNA 抽取受检者外周静脉血，用 Promega 公司的全血 DNA 抽提试剂盒提取 DNA，-4 存放。 1.2.2 AR 等位基因检测 5端及 3端引物序的列分别为5GAATCTTAACATGCTCTGAACC3, 5GCCCAGCCCTATACCTAGT3，均由上海生工生物工程公司合成；反应条件为：94 预变性 3 mi
9、n,94 变性 45 s,60 退火30 s, 72 延伸 30 s,循环 30 次于 72 终止延伸 5 min,4 保存。4取 10 L 的 PCR 产物与 2 L 加样缓冲液混匀后,于 120 g/L 聚丙烯酰胺凝胶上电泳（100 mV，15 h）, 保持低温。凝胶用硝酸银染色法显示结果。选取部分基因型为纯合子的 PCR 产物送上海生物工程公司进行测序。将其中的(AC)24 等位基因命名为 Z，并作为DNA 标准物与其他标本一起电泳，读取各个标本的基因型。据PCR 产物由大到小各等位基因依次命名为 Z+6、Z+ 4、Z+2、Z、Z-2、Z-4、Z-6。采用基因计数法计算各组基因型频率及等
10、位基因频率。 1.3 统计学处理 各组基因型频率和等位基因频率比较用 2 检验。统计分析采用SPSS 11.0 软件处理。 2 结 果 PCR 产物的长度为 132144 bp, 含(AC)n 的重复数 n 分别为21、22、23、24、25、26、27, 依次命名为 Z-6、Z-4、Z-2、Z 、Z+2、Z+4、Z+6 。各组等位基因分布频率见表 1。早期DN 组 Z-2 等位基因频率高于 NODN 组和 CON 组, 差异均有显著意义(2=6.88、10.51,P0.05) 。早期 DN 组含 Z-2 等位基因的基因型频率高于 NODN 组和 CON 组，差异均有显著意义（2=4.95、8
11、.15，P0.05、0.01） 。见表 2。表 1 各组等位基因频率分布比较例表 2 各组含 Z-2 等位基因基因型频率分布比较 53 讨 论 临床研究表明，DN 发生并不总与血糖水平和糖尿病病程有关,部分病人虽血糖控制良好也在早期即发生 DN,而有些糖尿病人却终身不发生 DN。因此，认为高糖血症是 DN 发生重要因素 ,但不是惟一因素。流行病学调查显示，在糖尿病病人中 DN 的发生均有家族集聚现象1,不同种族 DN 发病率差异悬殊2,这些都提示 DN 发生发展具有很高的遗传易感性。目前,多数学者认为,糖代谢的多元醇通路与糖尿病肾病、视网膜病变、神经病变等慢性并发症有密切关系3，4。AR 是多
12、元醇通路的限速酶, 该酶的活性在 DN 的发生、发展中起重要作用。在糖尿病高糖血症状态下,AR 被激活, 细胞生成大量山梨醇。由于山梨醇通过细胞膜的速度很慢,使其在细胞内积聚,引起细胞渗透性水肿和细胞结构的破坏；另外,AR 激活后, 还原型辅酶 (NADPH)的消耗增加,细胞内氧化 还原失衡,清除自由基的能力下降, 使组织损害, 最终导致病变的发生。 1995 年 KO 等5研究显示，在香港的中国人群 AR 基因转录起始点的上游 2.1 kb 处存在 (AC)n 微卫星多态性 DNA 标志, 并发现 Z-2 等位基因与糖尿病视网膜病变有密切关系。同时，KUMARAMANICKAVEL 等6和
13、PETROVIC 等7也分别在印第安人和高加索人中研究显示，Z-2 等位基因是 2 型 DM 视网膜病变的高度危险因素，提示 AR 基因 5端（AC）n 多态性与 DM 微血管并发症有关。YANG 等8研究显示，Z-2 等位基因携带者 AR 基因转录活性最高，进一步证明 AR 多态性与 DM 微血管并发症有密切关6系。LIU 等9 的研究显示，AR 基因 5端 (AC)n 多态性与 2 型 DM病人 DN 的发生相关，DM 病人中非微量蛋白尿组 Z-2 等位基因频率明显低于 DN 组，Z+2 等位基因频率明显高于 DN 组，提示 Z-2等位基因则是 DN 的独立危险因素，而 Z+2 等位基因是
14、 DN 的保护因素。然而，YAMAMOTO 等1对日本人群中的 1 型 DM 研究显示，Z+2 等位基因纯合子更易于发生 DN,携带有 Z+2 等位基因是 DN 发生发展的危险因素，其报道与 LIU 等9 研究结果正好相反。另有研究显示，Z-2 等位基因在 2 型 DM 中出现频率高于非 DM 病人，但未发现该等位基因与蛋白尿呈一致相关性。本研究显示，青岛地区汉族人中也存在该微卫星多态性, DN 组 Z-2 等位基因频率及含 Z-2 等位基因的基因型频率显著高于 NODN 组和 CON 组, 再次提示 AR 基因的 Z-2 等位基因可能是 DN 的易感因素。 综上所述, AR 基因 5端(AC
15、)n 多态与 DN 的发生有关，Z-2 等位基因可能是 DN 的易感基因。但微卫星基因的多态性,到底影响mRNA 还是蛋白质的表达,还需进一步的研究。 【参考文献】 1YAMAMOTO T, SATO T, HOSOI M, et al. Aldose reductase gene polymorphism is associated with progression of diabetic nephropathy in Japanese patients with type 1 diabetes mellitusJ. Diabetes Obes Metab, 2003,5(1):5157. 2WAT N M, LIU Y F. Diabetic nephropathy is associated with the 5end dinucleotide repeat polymorphism of the 7aldose reductase gene in Chinese subjects with type 2 diabetesJ. Diabetes Med, 2002,19(2):113118. 3李长贵,吕淑云, 綦玉琴,等. eNOS 基因第 7 外显子 894GT 点突变与早期糖尿病肾病并高血压的关系J. 青岛大学医学院学报, 2004,40（ 3）
