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1、 生 物 工 程 学 报 Chin J Biotech 2008, August 25; 24(8): 1464-1469 Chinese Journal of Biotechnology ISSN 1000- 2008 Institute of Microbiology, CAS & CSM, All rights reservedReceived: December 6, 2007; Accepted: March 13, 2008Supported by: the National Ministry of Science and Technology (No. 2005BA530C)
2、and Shanxi Science and Technology Department (No. 041001-1).Corresponding author: Jiahe Wu. Tel: +86-359-2126317; E-mail: 国 家 科 技 部 攻 关 引 导 项 目 (No. 2005BA530C)和 山 西 省 科 技 攻 关 项 目 (No. 041001-1)资 助 。研 究 简 报 菠菜甜菜碱醛脱氢酶基因在棉花中的过量表达和抗冻耐逆性分析罗 晓 丽 1, 肖 娟 丽 1, 王 志 安 1, 张 安 红 1, 田 颖 川 2, 吴 家 和 1,21 山 西 省 农 业
3、 科 学 院 棉 花 研 究 所 , 运 城 0440002 中 国 科 学 院 微 生 物 研 究 所 植 物 基 因 组 国 家 重 点 实 验 室 , 北 京 100101摘 要 : 分 离 出 菠 菜 甜 菜 碱 醛 脱 氢 酶 基 因 (SoBADH)构 建 成 由 CaMV35S 驱 动 的 双 元 植 物 表 达 载 体 pBSB, 农 杆 菌 菌 株LBA4404 携 带 该 载 体 转 化 棉 花 , 获 得 转 基 因 棉 花 植 株 。65 株 转 基 因 植 株 经 过 PCR 筛 选 、Southern blotting 分 析 证 明 有45 株 为 成 功 的 转
4、 化 株 , 外 源 基 因 已 经 被 整 合 到 棉 花 的 染 色 体 组 中 , 并 以 单 拷 贝 插 入 居 多 。对 部 分 株 系 的 SoBADH 基 因的 表 达 进 行 分 析 表 明 均 有 较 高 的 mRNA 和 蛋 白 的 表 达 。经 测 定 这 些 株 系 中 的 甜 菜 碱 脱 氢 酶 活 性 显 著 提 高 , 达 到 0.66 1.70 nmol/min/mg 水 平 。同 时 这 些 转 基 因 株 系 在 盐 胁 迫 下 比 对 照 长 势 强 , 株 高 和 地 上 部 分 的 鲜 重 显 著 高 于 非 转 基 因 对 照 ; 在 低 温 胁 迫
5、 下 , 这 些 转 基 因 株 系 表 现 出 显 著 的 抗 冻 性 能 。结 果 表 明 菠 菜 甜 菜 碱 醛 脱 氢 酶 能 够 在 异 源 植 物 棉 花 中 过 量 表达 , 并 具 有 较 高 的 酶 活 性 , 转 基 因 棉 花 可 作 为 抗 逆 育 种 的 种 质 材 料 。关 键 词 : 棉 花 , 菠 菜 甜 菜 碱 醛 脱 氢 酶 , 耐 盐 性 , 转 基 因Overexpression of Spinacia oleracea Betaine AldehydeDehydrogenase (SoBADH) Gene Confers the Salt and Co
6、ld Tolerant in Gossypium hirsutum L.Xiaoli Luo1, Juanli Xiao1, Zhian Wang1, Anhong Zhang1, Yingchuan Tian2, and Jiahe Wu1,21 Institute of Cotton Research, Shanxi Academy of Agricultural Science, Yuncheng 044000, China2 State Key Laboratory of Plant Genomics, Institute of Microbiology, Chinese Academ
7、y of Sciences, Beijing 100101, ChinaAbstract: The open reading frame of Spinacia oleracea Betaine Aldehyde Dehydrogenase (SoBADH) was retrieved from Spinacia oleracea and inserted into the Agrobacterium tumefaciens binary vector pBin438, which was driven by CaMV35S promoter, and produced the new bin
8、ary vector pBSB. A. tumefaciens LBA4404 carrying this plasmid was used in genetic transformation of plants. Forty-five primary transgenic plants were detected by PCR and verified by the Southern blotting from 65 regenerated plants, of which 27 transgenic plants had only one copy of T-DNA. The Northe
9、rn blotting and Western blotting analysis indicated that the SoBADH gene had been transcribed mRNA and expression protein in the transgenic cotton lines. The testing of SoBADH activity of transgenic plant leaves showed that the enzyme activity was much higher than that of the non-transgenic cotton.
10、The growth of transgenic plants was well under the salinity and freezing stress, whereas the non-transgenic plant grew poorly and even died. Challenging with salinity, the height and fresh weight of transgenic plants was higher compared with those of non-transgenic plants. 罗 晓 丽 等 : 菠 菜 甜 菜 碱 醛 脱 氢
11、酶 基 因 在 棉 花 中 的 过 量 表 达 和 抗 冻 耐 逆 性 分 析 1465JUnder the freezing stress, the relative conductivity of leaf electrolyte leakage of the transgenic cotton lines was lower than that of non-transgenic plants. These results demonstrated that the SoBADH gene could over express in the exogenous plants, and c
12、ould be used in genetic engineering for cotton stress resistance.Keywords: Gossypium hirsutum L., Spinacia oleracea betaine aldehyde dehydrogenase (SoBADH), salt tolerance, transgenic我 国 耕 地 中 , 干 旱 和 半 干 旱 地 面 积 约 占 耕 地 总面 积 的 75%, 盐 碱 地 所 占 的 比 率 也 达 到 6.7%并 且 分布 遍 及 全 国 各 地 。对 于 植 物 来 说 , 利 用 在 细
13、 胞 内 积累 可 溶 化 合 物 来 达 到 耐 干 旱 和 耐 盐 碱 的 机 制 是 一 致的 , 所 以 利 用 这 些 植 物 的 生 理 特 点 克 服 干 旱 和 盐 碱带 来 的 危 害 , 已 经 成 为 提 高 农 产 品 产 量 和 质 量 的 主要 研 究 领 域 之 一 。其 中 利 用 生 物 工 程 技 术 来 培 育 抗旱 、抗 盐 碱 的 农 作 物 品 种 被 认 为 是 解 决 之 一 问 题 的有 效 途 径 之 一 。自 然 界 中 存 在 一 些 抗 盐 碱 、抗 旱 植 物 , 它 们 在长 期 抵 御 外 界 干 旱 和 盐 碱 胁 迫 环 境
14、下 形 成 了 一 定 的适 应 机 制 。其 中 , 最 为 常 见 的 适 应 机 制 是 积 累 与 代谢 相 容 的 渗 透 保 护 性 物 质 , 如 多 元 醇 类 、脯 氨 酸 和季 氨 类 化 合 物 等 1。植 物 甜 菜 碱 是 季 氨 类 化 合 物 的一 种 , 被 认 为 生 物 体 中 起 无 毒 渗 透 保 护 作 用 的 最 主要 的 细 胞 相 溶 性 物 质 。甜 菜 碱 不 仅 能 使 细 胞 在 干 旱和 盐 碱 等 胁 迫 下 与 环 境 保 持 渗 透 平 衡 , 而 且 具 有 稳定 许 多 代 谢 过 程 中 的 蛋 白 质 酶 类 结 构 的
15、能 力 , 使 这些 酶 在 渗 透 胁 迫 下 能 继 续 保 持 活 性 2。植 物 中 的 甜菜 碱 一 旦 被 合 成 就 不 再 被 进 一 步 代 谢 , 积 累 在 细 胞中 作 为 永 久 性 或 半 永 久 性 渗 透 调 节 剂 。植 物 内 甜 菜碱 的 合 成 途 径 相 对 简 单 , 主 要 包 含 两 步 氧 化 反 应 , 涉 及 到 由 胆 碱 单 加 氧 酶 (CMO)催 化 胆 碱 形 成 甜 菜 碱醛 , 而 后 由 甜 菜 碱 醛 脱 氢 酶 (BADH)催 化 形 成 甜 菜 碱 , 其 中 BADH 是 合 成 甜 菜 碱 的 关 键 酶 3。有 关 这 2 个基 因 遗 传 转 化 已 经 有 一 些 报 道 , 表 明 这 些 转 基 因 作物 的 抗 逆 性 得 到 明 显 的 提 高 4-8。然 而 有 关 甜 菜 碱 醛脱 氢 酶 转 化 棉 花 的 研 究 尚 未 见 报 道 。我 们 把 菠 菜 中的 BADH 基 因 导 入 陆 地 棉 中 过 量 表 达 , 研 究 该 基 因能 否 在 异 源 植 物 棉 花 中 正 常 表 达 以 及 表
