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1、菠萝蛋白酶的制备及活性测定背景菠萝蛋白酶(Bromelain)，别名菠萝酶，是存在于菠萝(Anana COmOSl2S)植株中的蛋白质水解酶，为浅黄色无定形粉末，微有异臭。菠萝的果、茎、柄和叶片中都含有菠萝蛋白酶。一般从菠萝果中提取的称为果菠萝蛋白酶，从菠萝皮、茎中提取的为茎菠萝蛋白酶。八成熟的菠萝果汁含有约 04的菠萝蛋白酶，成熟的菠萝果汁含有 O3 左右的菠萝蛋白酶，茎汁含 87 的菠萝蛋白酶(Murachi，et a1，1964)。1981 年，Marcano首先发现菠萝汁中含有蛋白水解酶，随后 Willstatter，Bergmann 和 Martin 相继指出，菠萝蛋白酶存在于果、皮
2、和茎部中，存在于茎部的称为茎酶(Stembromelain EC34224)，存在于果汁中的酶称为果酶 (Fruit bromelainEC 3422 5) 。Murachi 和 Neurath、E1G harbawi 和Whitaker 采取层析法分离提取了菠萝蛋白酶并研究了它的活性成分。结构特性研究表明，果菠萝蛋白酶是酸性酶，等电点为 pH46，茎菠，约为 33，000，等电点为 pH95 ，其活性中心的氨基酸顺序和催化机理与木瓜蛋白酶相似，并确定茎菠萝蛋白酶为糖蛋白。Ota S et aL 研究指出，茎菠萝酶分子量为 36000，末端氨基酸残基是丙氨酸，果酶分子量为 30000，末端氨基
3、酸残基也为丙氨酸，碳水化合物分析与Muraclli 的分析结果相似。 1988 年，TL迈诺特等由十二烷基硫酸钠聚丙烯胺凝胶电泳(SDSPAGE) 测定果菠萝蛋白酶分子量 2220025080，等电点 3848。菠萝蛋白酶是各种酶的混合物，已知菠萝蛋白酶粗品中包含至少五种蛋白水解酶，也包含非蛋白水解酶，包括酸性磷酸酶和过氧化物酶，并含有淀粉酶和纤维素酶活性，还存在其他成分。菠萝蛋白酶成分的复杂性，限制了其在生产中的应用，特别是医药领域对功能成分的要求上，因此对菠萝蛋白酶的成分和各成分的具体功能的分析研究具有重要意义。菠萝蛋白酶纯品是一种糖蛋白，分子结构中含有一个寡糖分子，由木糖(xylose，
4、xyl) 、岩藻糖(fucose，Fuc)、甘露糖(mannose ，Mall) 和 N 一乙酰葡萄胺(N aceltylglucosamine，GIcNAC) 组成用离子交换柱层析、硫酸铵沉淀等方法提纯得到的菠萝蛋白酶进行研究表明，菠萝蛋白酶相对分子量为 33200D，等电点为 pH955，酶液的最大吸收波长为280nm，0051浓度的酶液在 280nm 的光吸收值达 0984(Murachi，et a1，1964)。分子中有 4 个 N 一乙酰化的氨基己糖，含糖 21 ，分子中有 285 个氨基酸残基，含氮量为 1588。在 Murachi 等研究的基础上，1989 年，Ritonja 等
5、排列出了菠萝蛋白酶主要组分的氨基酸顺序，有 20 种氨基酸，共 212 个，C 端的氨基酸为谷氨酸 (Glu)，N 端的氨基酸为丙氨酸(Ala)，相对分子质量为 23828。菠萝蛋白酶作为有活性的蛋白质，易受到温度、 pH、金属离子等的影响。研究表明(章佩芬等，1999)：菠萝蛋白酶的最适反应温度介于5560，温度再高，酶的热失活增强，反应速度下降；菠萝蛋白酶的最适 pH 在65 7 5，在 71 附近达最大值，在酸性环境中，酶反应速度下降快，在碱性下有个较宽的应用范围，酶较稳定的 pH 范围在 354 5；菠萝酶反应影响不大，MgCl2、CaCh 对酶有一定程度的抑制作用。生产过程中，为了保
6、护酶的活性，防止酶自身水解作用，常加入一些活性保护剂，如 EDTA、维生素 C、半胱氨酸等，提高酶的活性，延长酶的保存时间。1999 年， HHLiang 等人研究发现，茶多酚与菠萝蛋白酶结合后能提高酶的热稳定性，延长酶的半衰期。13 菠萝蛋白酶的提取纯化方法菠萝蛋白酶的提取纯化方法很多，目前，用于工业化生产的提取方法主要有三种(王平诸等，2002)：高岭土吸附法、单宁沉淀法、超滤浓缩法。流程(1)高岭土吸附法工艺流程菠萝下脚料(压榨 )一汁液(高岭土吸附)一吸附物( 洗脱、压滤)一洗脱液(盐析)一盐析物( 离心)一湿粗酶饼( 溶解、过滤)一澄清液(沉淀) 一湿酶(干燥)一精品(2)单宁沉淀法
7、工艺流程菠萝下脚料(压榨 )一汁液(去杂质)一澄清液( 加稳定剂)啼稳定液(加单宁)一单宁沉淀物( 洗脱)一滤液 (干燥 )一酶制品(3)超滤浓缩法工艺流程菠萝下脚料(压榨 )一汁液(去杂质)一澄清液( 超滤浓缩)一浓缩液(降温、加沉淀剂、沉淀)一湿酶(减压干燥 )一酶制品步骤24 1 1 酪蛋白溶液的配制称取酪蛋白 0609 ，加 005molL 磷酸二氢钠溶液 80mL，搅拌溶解后，加01molL 盐酸液调节 pH 至 70，加水至 100mL 即得。24 1 2 酶稀释液的配制称取 L半胱氨酸 0269， EDTA 0229，分别加适量水溶解后，调节 pH 至 60，加水定容至 100m
8、L，即得本液，现配现用。24 1 3 三氯乙酸溶液的配制称取三氯乙酸 17999，加醋酸钠 29949，和冰醋酸 189mL，加适量水溶解后，加水至 1000mL，摇匀，即得。24 1 4 磷酸缓冲液量取 02 molL Na2HP04 溶液 1 23mL 与 877mL 02 molL NaI-12P04溶液混合，定容至 500ml 即得 005molL ，pH60 磷酸缓冲液。24 1 5 层析缓冲液称取 1219 Hs 碱，0589 NaCl，1 molL 的 EDTA lmL，加蒸馏水稀释到 1L，用磷酸盐调 pH50 8O。梯度洗脱时高浓度氯化钠洗脱液的配制，加氯化钠87669，至
9、150molL，其余数据同上。24 1 6 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳所用溶液储存液：2 molL TrisHCI(pH88)，100mL称取 2429Tris 碱，加 50mL 蒸馏水，缓慢加浓盐酸至 pH88 ，再加蒸馏水至100mL。l molL Tris-HCI(pH68) ，100mL称取 1219 秭 s 碱，加 50mL 蒸馏水，缓慢加浓盐酸至 pH88 ，再加蒸馏水至100mL。10 (WV)SDS，100mL称取 109 SDS，加蒸馏水至 100mL，室温保存。50 (V 厂 V)甘油，100mL倒取甘油(100)50mL，加入 50mL 蒸馏水。l (WV) 溴酚蓝， 10
10、mL称取 100mg 溴酚蓝，加蒸馏水至 100mL，搅拌至完全溶解，过滤除去聚合的染料。工作液：A 液：丙烯酰胺储存液，10mL30(WV)丙烯酰胺，O8 (W ) 双丙烯酰胺。B 液： 4X 分离胶缓冲液， 100mL(4下保存)75mL 2molL Tris-HCl(pH88) ，4mL 10SDS，21mL 蒸馏水。C 液：4X 堆积胶缓冲液，100mL(4 下保存)50mL lmolL TrisHCl(pH68)，4mL 10SDS， 46mL 蒸馏水。10过硫酸铵，5mL059 过硫酸铵，5mL 蒸馏水，密封于磨口试管，4C 下保存。电泳缓冲液，lL39 Tris 碱，1449 甘
11、氨酸，lg SDS，加蒸馏水配成 1L 溶液，室温下保存。2x 样品缓冲液，100mL025molLIris-HCl(pH68)，4(WV)SDS， 20(VV) 甘油，痕量溴酚蓝，浓缩胶缓冲液(4X)5mL，SDS(干粉)0 49，甘油(50)4mL，溴酚蓝(1)201xl ，加水至 100mL。含 2巯基乙醇的样品缓冲液(1X)现用现配，稀释 2X 样品缓冲液储液，加入 2巯基乙醇至终浓度为 5(VV) 。灌制 x分离胶的计算A 液 X 3mL， B 液 25mL，蒸馏水(7 5 制 3)mL，10过硫酸铵 509L，TEMED 501t l(X8时，用 10u 1)总量 10mL。24
12、2 酶活测定方法对于供试酶液(24 41)量取 5mL(酶制品称取样品 00159 ，置研钵中，加适量酶稀释液研磨 10rain)用水移至 100mL 量瓶中，加水至刻度，摇匀，量取 5mL 至 10mL量瓶中，加酶稀释液至刻度，摇匀，放置 15min 后，准确量取 lmL，置具塞试管中于37+02 4C 水浴中保温 10min，精密量取在 3702C 中保温的酪蛋白溶液 5mL，迅速加入混匀，同时开动秒表，准确反应 10rain，立即加入三氯乙酸溶液 5mL，摇匀，过滤。另取样品溶液 lmL 置具塞试管中于 37+02C 保温 10min，精密加入 37三氯乙酸溶液5mL，准确反应 10ra
13、in，立即精密加入酪蛋白溶液 5mL，摇匀，过滤，滤液作空白，按照分光光度法(中国药典 1977 版)在 275nm 处测定吸光度(施特尔马赫，1992)。准确称取酪氨酸标准品 50mg，置 100mL 量瓶中，加 O1molL 盐酸溶液至刻度，摇匀，准确量取 lmL 置 10mL 量瓶中，加 O1molL 盐酸溶液至刻度，摇匀(每 lmL 含酪氨酸5099，以水作空白，在 275nm 处测定吸光度。在 pH70 ，37*(2 条件下，每分钟水解酪蛋白生成 lpgL 酪氨酸所需的酶量为一个活力单位。酶活力计算公式：每克(mL)菠萝蛋白酶活力 Ug(UmL) =石 Aso。11。意 以 10 样
14、品体积(重量 )A： 样品吸光度As：酪氨酸吸光度11：样品最后反应完毕体积10：反应时间50：每 mL 含有酪氨酸的烬数24 3 蛋含量测定方法采用考马斯亮兰 G250 法(George R，1973)测定蛋白质含量：标准蛋白溶液的配制：称取 10mg 牛血清白蛋白溶于去离子水并定容至 100mL，配成01mgmL 的标准蛋白溶液。考马斯亮兰 G250 染料试剂：称 100mg 考马斯亮兰 G250，溶于 50mL 95的乙醇后，再加入 120mL 85的磷酸，用水稀释至 lL，过滤后贮于棕色瓶中。标准曲线的绘制：取 7 支试管，编号后如表 1，混匀，放置 2min 后，在 595nm 波长
15、下比色测定(应在 lh 内完成)，以牛血清白蛋白含量(嵋)为横坐标，以吸光度为纵坐标。24 4 2 纳米 n02 吸附法供试酶液中加纳米 Ti02 搅拌均匀一离心(4000 rpm，15min) 一取沉淀用柠檬酸缓冲液洗脱一搅拌(30rain)一离心(4000 rpm，15rain) 一取上清液一超滤浓缩一冷冻干燥一酶制品。操作要点：吸附、洗脱：供试酶液置于玻璃或不锈钢容器中，加入纳米 Ti02 搅拌均匀，吸附2030min ，离心弃上清，沉淀用柠檬酸缓冲液洗脱，离心取上清。超滤：洗脱液先用截留分子量为 40KD 的超滤膜除去较大分子量的杂蛋白，再用截留分子量为 20KD 的超滤膜除去较小分子量的杂蛋白及其它小分子杂质，采用加去离子水多次超滤。冷冻干燥：据共晶点确定干燥参数。纳米 Ti02 吸附能力再生：纳米二氧化钛吸附洗脱后，采用 01molLNaOH 溶液浸泡，再用去离子水洗涤至中性，干燥后进行重吸附实验，吸附效果可恢复 90以上。24 4 3 高岭土吸附法供试酶液-an 4高岭土，搅 20min,10。C 吸附 3060min-,静置一吸出上清一沉淀用 16NaOH 调 pH657O 一加 79NaCl，搅 30min 一压滤，滤液用1：
