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1、民族传统发酵食品中耐胃肠道环境乳酸菌的筛选及其在酸乳发酵中的应用 孙敏 袁凤霞 曹晓虹 刘建利 王军节 张琇 李靖宇 覃璐琪 邓鹏程 王晓丹 北方民族大学生物科学与工程学院北方民族大学清真产业技术创新中心发酵酿造工程生物技术国家民委重点实验室宁夏特殊生境微生物资源开发与利用重点实验室 摘 要： 目前用于酸乳生产的乳酸菌大多为优良发酵菌种, 而非益生乳酸菌。进入人体后通过胃肠环境消化环境, 粘附定殖于肠道是作为益生菌的必要条件。本研究旨在筛选既能耐受人体胃肠道环境, 又有优良发酵特性的乳酸菌, 为后期益生菌筛选奠定基础。在前期从民族传统发酵食品中分离得到的乳酸菌中, 通过检测在人工胃肠道溶液中存
2、活率筛选胃肠道环境耐受性强的菌株, 再通过感官评价、质构测定等对耐受性强的菌株应用于酸乳发酵潜力进行综合性评价。结果显示, 在 58 株从民族地区传统食品中分离的乳酸菌中有 7 株菌在 4 种人工胃肠道溶液存活率均在 50%以上, 其中 5 株菌的发酵酸乳感官评价得分较高;而菌株“新 E6”发酵的酸乳在质构破裂力、最大粘附力、硬度、内聚力、弹性、胶黏性、咀嚼性以及粘度、持水力等指标都较优, 分子生物学鉴定结果“新 E6”为坚强肠球菌 (Enterococcus durans) , 为后续益生菌的开发奠定基础。关键词： 胃肠道; 乳酸菌; 酸乳; 作者简介：孙敏 (1994-) , 女, 四川南
3、充人, 硕士研究生。E-mail:。作者简介：刘建利 (1973-) , 男, 陕西凤翔人, 副教授, 博士, 主要从事食品微生物方面研究。E-mail:LJL。收稿日期：2017-07-21基金：北方民族大学重点科研项目 (2015KJ36) ;北方民族大学“清真食品研发”特色科研团队;北方民族大学引进人员科研启动费Screening of lactic acid bacteria strainswith resistance to gastrointestinal environment isolated fromethnic traditional foods and applicati
4、on in fermented yoghurtSUN Min YUANFeng-xia CAO Xiao-hong LIUJian-li WANG Jun-jie Zhang Xiu LI Jing-yu QIN Lu-qi DENG Peng-cheng WANG Xiao-dan College of Biological Sciences and Engineering, Halal Industry Innovation Centre, North Minzu University, Key Laboratory of Fermentation and Brewing Engineer
5、ing and Biotechnology, State Ethnic Affairs Commission, Key Laboratory of Microbial Resources Development and Utilization in Special Habitats, Ningxia; Abstract： Starter agents used in yogurt production are mostly good fermentation lactic acid bacteria, but not probiotics strains. It is necessary co
6、ndition of lactic acid bacteria as probiotics that strains must go through gastrointestinal environment, then adhere and colonize in the intestinal tract. In this paper, the highly tolerant lactic acid bacteria strains isolated from the ethnic traditional food were screened by detecting the survival
7、 rate of strains in the artificial gastrointestinal solution, Then the potential application on yogurt of these strains were also comprehensively evaluated by the sensory evaluation and the texture analyzer. The results showed that survival rate of 7 strains were more than 50% in the 4 kinds of arti
8、ficial gastrointestinal solution among 58 strains of lactic acid bacteria. The score of sensory evaluation of 5 strains are higher. The Xin E6 demonstrated outstanding on yoghourt texture rupture force, the maximum e adhesion force, hardness, cohesiveness, elasticity, tackiness, chewiness and viscos
9、ity, holding water capacity. The Xin E6 is Enterococcus durans by molecular biology methods. “Xin E6 has potential application in the development of probiotics starter agent.Keyword： Gastrointestinal environment; lactic acid bacteria; yoghurt; Received： 2017-07-21西北、西南、东北民族地区的少数民族食用各种发酵食品有着悠久的历史, 他们
10、千百年来沿袭古老而传统的方法制作酸乳、奶酪、奶豆腐、奶酒、曲拉、乳扇、乳饼、浆水、酵子、泡菜、酸菜等发酵食品, 生产方法简单、产品风味独特、组织细腻、口感纯正, 在当地自然温度下存放较长时间还能保证其口感和状态, 因此, 在这些传统乳酸菌发酵食品中应该含有丰富、独特的优良乳酸菌资源。目前, 用于酸乳发酵工业生产的保加利亚乳杆菌 (Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus) 和嗜热链球菌 (Streptococcus thermophilus) 等菌株, 只是发酵特性优良的菌种, 而非益生乳酸菌1,2。胃是重要的消化器官, 胃液的强酸性环境和其中的蛋白
11、酶共同构成了阻止大多数微生物进入肠道的天然屏障, 肠道 p H 为 8.0 的弱碱性环境及其分泌的胆汁、胰蛋白酶也对外源微生物有拮抗作用。因此, 耐受胃肠道环境, 是益生乳酸菌的最基本特性。而乳酸菌胃肠道环境耐受性的研究大多仅仅集中菌株筛选, 很少同时兼顾考察其优良发酵特性的研究3-11。本课题组前期已从新疆、西藏、青海、内蒙、甘肃、云南等全国 20 个省份的少数民族传统发酵食品中分离得到大量的乳酸菌, 本研究拟从中筛选耐胃肠道环境的乳酸菌菌株, 并进行酸乳发酵试验, 为开发益生优良酸乳发酵菌剂提供候选菌种和理论依据。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 乳酸菌株本实验室保存的从新疆、西藏、青
12、海、内蒙、甘肃、云南等全国 20 个省份的酸乳、奶酪、奶豆腐、奶酒、曲拉、乳扇、乳饼、浆水、酵子、泡菜、酸菜等少数民族传统发酵食品中分离的乳酸菌, 随机选取 58 株菌进行实验;保加利亚乳杆菌 (Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus) 由宁夏夏进乳业股份有限公司惠赠。1.1.2 实验试剂胰蛋白酶 (北京拜耳迪生物公司) , 胃蛋白酶 (biotopped 公司) , 胰蛋白胨 (英国 Oxoid 公司) , 牛胆盐 (biotopped 公司) , 酵母提取物 (英国 Oxoid 公司) , 牛肉浸粉 (青岛海博生物公司) , 细菌基因组提取试剂
13、盒 (康为世纪生物科技有限公司) , 2Easy Taq PCR Super Mix (+dye) (北京全式金生物技术有限公司) , 柠檬酸二铵, 柠檬酸铵, 蔗糖, 碘, 三氯乙酸, 邻苯二胺, 盐酸, 亚硫酸氢钠, 酚酞, 氢氧化钠, 酒精, 琼脂糖, 氯化钙, 氯化钠, 磷酸二氢钠, 磷酸氢二钠, 无水乙醇, 氢氧化钾 (天津市大茂化学试剂厂) , 均为分析纯;纯牛奶 (伊利乳业有限责任公司) 。1.1.3 溶液酸溶液12-15:用 1mol/L 的盐酸溶液调节生理盐水的 p H 为 3.0, 于 121下灭菌 20min。胆盐溶液12-13,15:准确称取 0.3g 牛胆盐, 加生理
14、盐水溶解定容至 100mL, 于 121下灭菌 20min。人工模拟胃液12,14,16-17:称取 0.3g 胃蛋白酶, 溶于 100mL 5%Na Cl 溶液中, 用 1mol/L 的盐酸溶液调节 pH 为 3.0, 经微孔滤膜过滤除菌后备用。人工模拟胰液17-18:称取 0.1g 胰蛋白酶, 溶于 100mL 5%Na Cl 溶液中, 用1mol/L 的氢氧化钠溶液调整 p H 值为 8.0, 经微孔滤膜过滤除菌后备用。1.1.4 培养基MRS 培养基 (1L) :胰蛋白胨 10g、酵母提取物 5g、柠檬酸二铵 2g、牛肉浸粉10g、无水乙酸钠 5g、葡萄糖 20g、吐温 80 1mL、
15、硫酸镁 0.58g、磷酸氢二钾2.6g、硫酸锰 0.19g, 调节 p H 为 6.26.4 之间。1.1.5 引物27F:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG1492R:GGTTACCTTGTTACGACTT由生工生物工程 (上海) 股份有限公司合成。1.1.6 实验仪器质构仪 (美国 FTC 公司, TMS-PRO 型) , 粘度计 (上海庚庚仪器设备公司, NDJ-8S) , 快速梯度 PCR 仪 (美国 Bio-Rad 公司, S1000 型) 、微型旋涡混合器 (Q/BKYY15-2000 型) 、台式高速冷冻离心机 (Sigma 公司, 1-14 型) 、双人型超净工作台 (苏
16、州净化设备有限公司, SW-CJ-2J 型) 、紫外分光光度计 (美国赛默飞世尔科技公司) , 水浴锅 (浙江余姚金电仪表有限公司, HH-4 型) 、压力蒸汽灭菌器 (LDZX-50KBS 型) 、恒温培养振荡器 (ZWY-100H) 、数显电热恒温培养箱 (上海精宏实验设备有限公司, SD303-4A 型) 。1.2 实验方法1.2.1 乳酸菌的活化取保藏的菌株接入 MRS 液体培养基中, 37, 100rpm 摇床培养 24h, 备用。1.2.2 乳酸菌菌株肠胃道耐受性实验参考赵瑞香3、柏建玲4和朱宏5等方法, 稍作改动。将活化后的菌株按 2%的接种量接到 MRS 培养基中, 培养 24 小时后, 吸取培养液 2mL, 12000rpm 离心2min, 收集菌体, 加入 2mL 的无菌生理盐水重悬, 准确吸取 0.5m L 菌悬液分别加入 4.5mL 酸溶液、胆盐溶液、人工模拟胃液和人工模拟胰液和生理盐水;37, 100r
