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1、心肌细胞及心肌组织 RT-PCR 实验方案2 代 CFbs（心肌成纤维细胞， 40ml 培养瓶内，瓶底面积约 25mm）换无血清培养基一天，镜下见细胞几乎呈融合状态。实验准备：实验前两天开始：浸泡1.DEPC 用纯水按 0.1%浓度配制 ，1.1 升（1 升浸泡，100ml 配酒精）2.Tip 10L 200L 1ml （多多益善，尤其是 10L tip）3.EP Tube （1.5ml ） （多多益善，尤其是需要分装试剂时）4.PCR Tube（200L 或 500L） （视情况定） 5 电泳槽高温烘烤（160 度 5 个小时）三个饭盒（分别装大枪头，中小枪头，EP 管）三个玻璃瓶（分装异丙
2、醇，氯仿和乙醇）电泳用1.Agarose 2.Golden View 3.DNA Marker4.上样缓冲液0.25%溴酚蓝0.25%二甲苯青 FF30%甘油6缓冲液，4保存5.电泳缓冲液Tris 54g硼酸 27.5g0.5M EDTA 20ml？ pH8.0蒸溜水 1000ml5TBE （贮存液）再将 5TBE 稀释 10 倍成 0.5TBE 就可以在电泳时使用（即工作液浓度） ，如取 50ml 贮存液+450ml水500ml 工作缓冲液其他：PE 手套 实验前一天需要准备：一，引物的配制：1. 将所合成的目的基因和内参上下游引物(1OD)用 0.1% DEPC 水溶解。2. 根据各个引物
3、分子量的不同，计算加 0.1%DEPC 水的量，使其终浓度均为20pmol/l。质量数（g）=OD 值*33分子量=碱基数*324.5摩尔数（nm） =质量数/分子量加入水量（l）=摩尔数（nm）*1000/203. 每条 2 OD 的引物一般可获得 0.5mL 左右的终容积，所以最好分装后于-20冰箱中冻存，放置反复冻融。二，预先混合以下试剂：注：中数字为 Takara 试剂盒中编号。11MgCl2 20L810RT Buffer 10L5RNase Free Water 37.5 L10dNTP 10L以上组成 Mix 液 77.5L三，阳性对照 RNA 易降解，置于-80 冰箱中保存。另
4、外，一些蛋白试剂，如酶，需要分装，避免反复冻融。实验当天需要准备：开机预热紫外分光光度计、PCR 仪、水浴箱（60） 。注意适时将试剂从冰箱中取出，溶解。RNA 提取1. 每孔加入 3mlPBS，冲洗 2 遍，直至洗净培养基。 （如果心肌细胞生长在 40ml 培养瓶中，则以下所加试剂均需乘以 2.5）2. 加 TRIzol 每孔 1ml。3. 轻柔的用移液枪吹打几次。4. 吸取样品到一个 1.5ml EP 管中5. 室温放置 5 分钟。6. 加入 0.2ml 氯仿（chloroform） 。7. 用手剧烈震荡 ep 管 15 秒，充分混匀。8. 12000 转 4离心 10 分钟。 （可利用三
5、次离心时间配做电泳胶） 。9. 仔细转移上层水相到一个新 EP 管中，注意千万不能贪多，把中间相和有机相吸入。10. 加 0.5ml 异丙醇（isopropyl alcohol）11. 室温放置 10 分钟。12. 12000 转 4离心 10 分钟。13. 去上清，加 1ml 乙醇。14. 震荡混匀。15. 7500 转 4离心 5 分钟。16. 去上清，简单通风 5-10 分钟干燥 RNA。 （不能太干，肉眼不能明显看到水分即可）17. 加 50L 无 RNAase 水，吹打数次。18. 55-60水浴 10 分钟。19. 下一步实验或冷冻保存。此时可以取出 RT-PCR 的试剂盒，准备解
6、冻。RNA 的纯度和浓度检测1) 预热紫外分光光度计（进口那台） 。使用应用程序中的 A260/A280，ssDNA/RNA 程序。2) 用灭活的 DEPC 水 1000l 调零。3) 取 RNA 样品 1l，加入灭活的 DEPC 水 1000 l，混匀。 （如果 RNA 浓度过稀，则可适当减少稀释倍数，改用微量比色杯。 ）4) 直接读取 RNA 浓度和 Ratio，并根据稀释情况得出实际的 RNA 浓度，重复操作三次取平均值。5) RNA 的 Ratio 均在 1.7-2.0 之间。RNA 浓度在 0.5g/l-1g/l，分装 10l 一管，于-70冰箱中冻存。RNA 完整性的检测1) 制备
7、琼脂糖凝胶，称取琼脂糖凝胶 0.4g，加入 0.5TBE 缓冲液 40ml，微波炉加热至熔化。2) 最后配成终浓度为 1%琼脂糖凝胶液体。3) 加入 Golden View 2l，混匀。4) 冷却至室温。5) 在水平电泳槽上制胶，凝固后浸入 0.5TBE 缓冲液中，除去样本梳。6) 取 1gRNA 与 1.5l 甲醛、4.5l 甲酰胺混合，加入 1l 上样缓冲液(0.25% 溴酚蓝；40% 蔗糖)，75mv 电泳至溴酚蓝位于琼脂糖凝胶的 2/3 处。RT-PCR 产物电泳分析1. 取 10l RT-PCR 产物与 2l 上样缓冲液混合后上样于 1%琼脂糖凝胶，同时以 20l Ladder 点样
8、，以 0.5TBE 为缓冲液电泳。2. 70V 电泳至溴酚蓝位于琼脂糖凝胶的 2/3 后，紫外灯下观察，扫描、拍照并进行图像分析。3. 图像分析处理系统进行辉度扫描，并以内参校正作相对量分析，数值以两者之积分吸光度的比值表示。PCR 产物测序：扩增好的目的基因的 PCR 产物(50l)进行测序。RT-PCR：注：中数字为 Takara 试剂盒中编号。1，取出一个 200LPCR 反应管，顺次加入以下成分：MMix 液 7.75L2RNase Inhibitor 0.25L1AMV 0.5L3Random 9mers 0.5LRNA 样品 1L以上为 RT 反应体系共 10L2，将反应管置入 P
9、CR 仪中，按以下设置参数进行逆转录反应：（我已经预设黑 PCR 仪中Ps-RT1-1 程序）30 10min45 30min99 5min5 5min（1 cycle）3，上述逆转录过程完成之后，将此管中另加入以下成分：95*PCR buffer 10L5RNase Free Water 28.75L6Takara Taq 0.25L上游引物 0.5L下游引物 0.5L4 重新放入 PCR 仪中按一下方案进行：（本实验方案为 ECE-1，其他样品则灵活变通）94 2min94 30sec45/51 梯度 40sec 40 cycles72 30sec72 7min阳性 RNA 对照RT 部分：MMix 液 7.75L2RNase Inhibitor 0.25L1AMV 0.5L3Random 9mers 0.5L14positive control RNA 1L30 10min45 30min99 5min5 5min（1 cycle）PCR 部分：95*PCR buffer 10L5RNase Free Water 28.75L6Takara Taq 0.25L12F-1 Primer 0.5L13R-1 Primer 0.5L94 2min94 30sec55 30sec 30 cycles72 1 min72 7min扩增片断 462bp
