环状 RNAs 在消化系恶性肿瘤中的表达、生物学功能及临床应用研究进展 何存存 吴会超 成绍敏 遵义医学院附属医院 摘 要： 环状 RNAs 高度稳定, 且不易被核酸外切酶降解, 能够存在于外泌体和血液中其在食管鳞癌、胃癌、结直肠癌、肝细胞癌、胰腺导管癌中表达异常, 具有微小 RNA 海绵、参与蛋白翻译、调控基因转录及剪切等功能, 通过多种信号通路在上述消化系肿瘤发生、发展及转移中发挥重要调控作用, 并且可以作为分子标志物用于消化道肿瘤的诊断和预后判断关键词： 环状 RNA; 食管鳞癌; 胃癌; 结直肠癌; 肝细胞癌; 胰腺导管癌; 微小 RNA; 作者简介：吴会超, E-mail:wuhuichao985@基金：贵州省科技厅、遵义医学院、遵义市科技局联合基金资助项目 (LKZ[2013]-13 号) 环状 RNAs 是非编码 RNAs (ncRNAs) 家族中的一类竞争性内源性 RNAs (ceRNAs) [1], 其分子结构呈闭合环状, 以共价键结合, 不含有 5'-帽和 3'-多聚腺苷酸A 尾结构, 因此对核糖核酸酶不敏感, 比线状 RNA 更加稳定, 且不易被降解[2]环状 RNAs 与人类疾病息息相关, 估计约 15%的活性基因会产生环状 RNAs[3]。
新近的研究证实, 环状 RNAs 在食管鳞癌、胃癌、结直肠癌、肝细胞癌、胰腺导管癌中表达异常, 与细胞间黏附、细胞周期调节以及肿瘤的增殖、侵袭、转移密切相关[4]本文就环状 RNAs 在消化系恶性肿瘤中的表达、生物学功能及临床应用研究进展作一综述1 环状 RNAs 在消化系恶性肿瘤中的表达环状 RNAs 在食管鳞癌、胃癌、结直肠癌、肝细胞癌、胰腺导管癌等消化系恶性肿瘤中均有表达异常, 并与肿瘤分期、浸润深度及淋巴结转移等临床病理参数相关1.1 环状 RNAs 在食管鳞癌中的表达有研究表明, 环状 RNA cir-ITCH 在食管鳞癌组织中呈低表达, 作为 miR-7、miR-17 和 miR-214 的海绵, cir-ITCH 可以增加其亲本基因 ITCH 的表达水平, 促进磷酸化 Dvl2 的泛素化和降解, 抑制 Wnt/β-catenin 信号通路, 从而对食管鳞癌产生抑制作用[5]Xia 等[6]通过对 51 例食管鳞癌患者的研究发现, 与癌旁组织相比, 环状 RNA hsa-circ-0067934 在食管鳞癌组织中显著过表达, 且其高表达程度与食管鳞癌分化程度、TNM 分期等有关。
通过 siRNA 体外沉默, hsa-circ-0067934 能够抑制食管鳞癌细胞的增殖迁移和阻遏细胞周期进展, 这表明 hsa-circ-0067934 有望成为食管鳞癌的一种新型的诊断标志物和靶向治疗目标1.2 环状 RNAs 在胃癌中的表达Pan 等[7]检测了 102 例原发胃癌组织及其配对的癌旁组织中的环状 RNA-7 (ciRS-7) , 结果显示 ciRS-7 在胃癌组织中的表达显著上调, 其过表达与胃癌的肿瘤分期、淋巴结转移和远处转移相关, 提示其可作为胃癌预后不良的一个独立危险因素通过进一步的细胞实验证实, ciRS-7 过表达可激活PTEN/PI3K/AKT 信号通路来抑制微小 RNA-7 (miR-7) 功能, 从而影响 miR-7 在胃癌中的肿瘤抑制作用当然也有学者通过对基因组位点扩增的研究发现, 环状 RNA circ-PVT1 在胃癌组织中表达上调, 且其作为 miR-125 家族成员的海绵, 能够促进胃癌细胞增殖[8]环状 RNA Has-circ-0000190 首次被发现在胃癌组织和血浆中表达下调, 其表达水平与肿瘤大小、淋巴结转移、远处转移、TNM分期和 CA19-9 水平显著相关[9]。
1.3 环状 RNAs 在结直肠癌中的表达Dou 等[10]对来源于同一结直肠癌细胞株的三种细胞 DLD-1 (既含 KRAS 野生型又含 KRAS 突变型) 、DKO-1 (只含 KRAS 突变型) 和 DKs-8 (只含 KRAS 野生型) 进行检测, 发现与 DKs-8 细胞株相比, 环状 RNAs 在 DLD-1 和 DKO-1 细胞株中显著下调, 大部分环状 RNAs 在 KRAS 突变的结直肠癌细胞中表达下调, 表明了KRAS 基因突变对环状 RNAs 的表达产生广泛影响此外, 在这三个细胞株分泌的相应的细胞外囊泡 (EVs) 中也检测到了环状 RNAs, 且外泌体中环状 RNAs 表达比细胞内丰富Weng 等[11]研究显示, ciRS-7 在结直肠癌组织中显著上调, 其过度表达与结直肠癌患者转移和不良预后相关进一步通过细胞实验表明, ciRS-7 在 HCT116 和 HT29 细胞中过表达可阻碍 miR-7 的肿瘤抑制作用, 激活其靶基因, 促进结直肠癌细胞增殖、侵袭及转移1.4 环状 RNAs 在肝细胞癌中的表达Xu 等[12]研究发现, ciRS-7 与 miR-7 在肝癌组织中的表达呈负相关, 而与miR-7 的靶基因磷脂酰肌醇-3 激酶催化亚基 δ (PIK3CD) 和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白 (m TOR) 表达呈正相关, ciRS-7 可通过抑制肝癌中 miR-7 表达, 间接抑制 PI3K/Akt/m TOR 信号通路, 从而促进肝癌微血管浸润 (MVI) 。
肝细胞癌组织中 ciRS-7 表达与患者年龄、甲胎蛋白水平、肿瘤直径、肿瘤包膜、MVI 程度和不良预后显著相关, 提示 ciRS-7 可能参与肝细胞癌的发生发展, 能够作为肝细胞癌预后判断的生物标志物和微血管浸润的靶向治疗目标一项针对肝细胞癌的遗传学和流行病学的研究发现, cir-ITCH 在肝细胞癌组织中的表达显著低于配对的癌旁组织, COX 回归分析提示 cir-ITCH 表达相对较高的肝细胞癌患者有着相对良好的预后, 揭示了 cir-ITCH 可能对肝细胞癌有抑制作用, 可作为肝细胞癌患者易感性和预后评估的生物标志物[13]由此可知, 环状 RNAs 在肝细胞癌中的表达与一些传统的生物标志物如甲胎蛋白和 miRNAs 有关, 它们可能与 miRNAs 相互作用, 充当 miRNA 海绵, 调控 miRNA 靶基因的表达, 影响肝癌的发生发展此外, 与 miRNAs 相比, 环状 RNAs 更稳定, 甚至可以在外泌体中检测到因此, 我们认为环状 RNAs 和传统的生物标志物的联合应用可为肝细胞癌的诊断提供更好的理论依据1.5 环状 RNAs 在胰腺导管腺癌中的表达Li 等[14]使用基因芯片对胰腺导管腺癌中环状 RNAs 表达谱进行研究, 并使用微阵列分析发现, 共有 351 种环状 RNAs 在胰腺导管腺癌组织及其配对的正常组织之间存在表达差异, 其中在肿瘤组织中有 209 种环状 RNAs 表达上调, 142 种环状 RNAs 表达下调。
后来对随机选取的 7 种有表达差异的环状 RNAs 进行验证, 包括有 2 种表达上调的 (hsa-circ-0001946、hsa-circ-0005397) 和 5 种表达下调的 (hsacirc-0006913、hsa-circ-0000257、hsa-circ-0005785、hsa-circ-0041150 和 hsa-circ-0008719) , 结果发现上述环状 RNAs 表达模式与基因芯片数据一致在这些环状 RNAs 中, hsa-circ-0005785 有可能作为微小 RNA海绵抑制 miR181a 和 miR181b, 而 miR-181a 在胰腺癌生长和转移过程中发挥至关重要的作用[15], miR-181b 的表达与胰腺癌细胞对吉西他滨耐药密切相关[16]2 环状 RNAs 的生物学功能2.1 作为竞争性内源性 RNAs 或微小 RNA 海绵Hansen 等[3]的研究发现, 一些环状 RNAs 的 RNA 结合蛋白 (RBP) 丰富, 可充当微小 RNA 海绵, 通过自身含有的微小 RNA (miRNA) 结合位点, 与 miRNA 竞争性结合 mRNA 3'非翻译区 (3'UTR) 的 miRNA 识别元件 (MRE) , 降低 miRNA 对其靶基因的抑制或降解作用, 从而增加其靶基因的 mRNA 及蛋白的表达水平, 参与肿瘤发生发展过程中重要的生物学调控[17]。
其中 ciRS-7 也被称为小脑变性相关蛋白 1 反义转录物, 它拥有至少 70 个 miR-7 的选择性保守结合位点, 充当miR-7 海绵, 有效调控 miR-7, 从而降低 miR-7 对其靶基因的抑制作用[18]CiRS-7 过表达可间接增加 miR-7 靶基因下游的表皮生长因子受体 (EGFR) 表达, 进而调控细胞的生长、增殖、分化和肿瘤细胞的信号转导[11]同样地, 另一个作为微小 RNA 海绵的 circRNA 是 cir-ITCH, 它跨越了 E3 泛素化蛋白连接酶的几个外显子, 由亲本基因 ITCH 衍生而来, 含有 miR-7、miR-17 和 miR-214 的结合位点[19]除此之外, 雄性性别决定基因含有 miR-138 的保守结合位点[3]总之, 环状 RNAs 作为竞争性内源性 RNAs 或微小 RNA 海绵的功能目前已经得到证实, 但其在肿瘤发生发展中的具体生物学机制及能否通过干预此途径来提高肿瘤分子靶向治疗仍有待进一步研究2.2 参与蛋白翻译起初认为, 环状 RNAs 不含有 5'-帽和 3'-多聚腺苷酸 A 尾结构, 且大多数存在于细胞质中, 缺乏相应的内部核糖体进入位点 (IRES) , 不能翻译出蛋白质[20]。
但后来有研究报道, 一部分内源性环状 RNAs 能够被翻译成蛋白质[21]一些研究表明, 在起始密码子上游含有 IRES 序列的人工环状 RNAs 能翻译出功能性的绿色荧光蛋白 (GFP) [20]Legnini 等[22]发现, 环状 RNA circ-ZNF609 在小鼠成肌细胞中可被 IRES 驱动, 转化为蛋白质Pamudurti 等[23]对飞行昆虫头部提取物的质谱分析发现, 环状 RNA circ Mbl3 也能够翻译出蛋白质一些具有多个标记编码序列的人工合成环状 RNAs 在没有任何特定的 IRES 驱动的情况下, 可通过类似于滚环扩增 (RCA) 的机制, 也能够翻译蛋白质[21]2.3 调控基因转录及剪切环状 RNAs 还可以调控基因转录, 其机制多种多样, 比如以通过 miRNAs 发挥作用这一部分环状 RNAs 基本存在于原核生物例如环状 RNAs circ-EIF3J 和circ-PAIP2 可以通过与 U1 核小核糖蛋白体和 RNA 聚合酶Ⅱ相互作用, 增强 He La 细胞和 HEK293 细胞中亲本基因的表达[24]也有研究发现, 环状 RNAs ci-ankrd52 和 ci-sirt7 也能够通过与 RNA 聚合酶Ⅱ相互作用在其亲本基因中起到正反馈调控功能[25]。
这表明环状 RNAs 也能调控亲本基因转录Ashwal-Fluss等[26]发现环状 RNAs 可以通过竞争剪接因子调控亲本基因表达以上研究表明, circRNAs 在亲本基因的不同表达水平即可起到正反馈调控, 又可起到负反馈调控2.4 调控肿瘤信号通路环状 RNAs 通过多种机制参与肿瘤分子生物学调控, 其中最重要的为 ciRS-7/miR-7 调控轴越来越多的证据显示, miR-7 在肝细胞癌、胃癌、结直肠癌、乳腺癌、宫颈癌、肺癌、舌癌及神经鞘肿瘤等多种肿瘤中作为抑制基因参与癌症发生Chou 等[27]研究发现, 在肺癌中 ciRS-7 能增加 miR-7 靶基因的表达, 显著降低肿瘤抑制基因 miR-7 的活性而 miR-7 参与多种肿瘤信号通路, 如miR-7 可直接下调 EGFR、m TOR、PIK3CD、胰岛素受体底物 1 (IRS-1。