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1、不同植物无色花青素还原酶及其基因的生物信息学分析 李蒙 鲍锋 西安文理学院生物与环境工程学院 摘 要： 对 9 种不同植物的无色花青素还原酶及其基因进行生物信息学分析, 探索该蛋白的结构并预测 LAR 的功能。通过生物信息学软件对 Gen Bank 中已经登录的不同植物 LAR 基因和氨基酸序列进行分析, 对其组成成分、理化性质、翻译后修饰位点、功能域、二级结构、亚细胞定位、分子进化等进行预测和推断。结果表明, 9 种植物无色花青素还原酶基因全长在 1.01.2 kb, 编码 342391 个氨基酸, 不具有信号肽;9 种植物 LAR 都具有蛋白激酶 C 磷酸化位点、酪蛋白激酶磷酸化位点和 N
2、-端肉豆蔻酰化位点, 个别植物 LAR 具有 N-端糖基化位点、酪氨酸激酶磷酸化位点和 c AMP 和 c GMP 依赖蛋白激酶磷酸化位点;二级结构以 螺旋和无规则卷曲为主;进化分析表明禾本科的玉米与其他科植物亲缘关系较远。关键词： 无色花青素还原酶; 生物信息学; 结构预测; 功能分析; 作者简介：李蒙 (1988) , 男, 助理实验师, 硕士, 研究方向为生物化学与分子生物学。Bioinformatics Analysis of Leucoanthocyanidin Reductase and Gene in Different PlantsLI Meng BAO Feng Colleg
3、e of Biological and Environmental Engineering, Xian University of Arts and Sciences; Abstract： The leucoanthocyanidin reductase (LAR) and its gene in nine kinds of plants were analyzed by using bioinformatic method. The nucleic acid sequences and amino acid sequences of LARs registered in Gen Bank w
4、ere analyzed by using bioinformatic software, and their compositions, physical and chemical properties, post-translational modification sits, functional domains, secondary structure, subcellular location and molecular phylogenetic evolution were predicted and inferred. The results demonstrated that
5、the LAR genes in nine kinds of plants was 1. 0 1. 2 kb in overall length, and they coded 342 391 amino acids, but had no signal peptide. All LARs had protein kinase C phosphorylation sites, casein kinase phosphorylation sites and N-myristoylation sites, and the LAR in several plants also had N-glyco
6、sylation sites, tyrosine kinase phosphorylation sites, and c AMP-dependent and c GMP-dependent protein kinase phosphorylation sites. The secondary structure mainly was of alpha helix and random coil. The evolutionary tree showed that the gramineous maize and the plants in other families had a distan
7、t genetic relationship.Keyword： Leucoanthocyanidin reductase; Bioinformatics; Structural prediction; Functional analysis; 无色花青素还原酶 (Leucoanthocyanidin reductase, LAR, EC 1.17.1.3) 是植物黄酮类化合物合成路径中一个关键酶, 在苯丙氨酸代谢通路中, 其催化无色花青素转化为儿茶素1, 而儿茶素是具有重要生理活性的次生代谢产物, 具有如免疫调节、抗氧化、抗癌活性等多种功效2-4。在多种植物中研究发现儿茶素的积累与 LAR 基
8、因的表达相关5-7。目前在 Gen Bank 数据库中登陆的植物 LAR 的基因序列有 1000 多条, 已从葡萄6、苹果8、豆类9、苜蓿10等植物中分离出不同拷贝数的 LAR 基因, 而 LAR 的活性也已经在大麦11、豆类12、茶树13等植物中得到鉴定。LAR 在儿茶素合成途径中尤为重要14, 有研究发现植物儿茶素的积累与 LAR 的转录因子调控相关5, 并且受种内和种间差异的明显影响15。因此, 探讨 LAR 基因的表达调控及酶的功能特性具有重要的科学意义。随着大多数儿茶素合成路径中相关酶的基因得到分离与克隆16, 在后续基因的表达调控的研究中, 将有利于进一步了解植物生长发育过程中黄酮
9、类物质的积累过程。本文通过生物信息学方法, 对不同植物 LAR 基因及其氨基酸序列的结构特点与特征进行了预测与分析, 以期为研究 LAR 家族蛋白的生化特性和调控机理提供理论依据。1 材料与方法1.1 材料在 NCBI 中查询 9 种不同植物的无色花青素还原酶的核酸序列及其对应的氨基酸序列:玉米 (NM-001155409) 、苦荞 (KC404849) 、苹果 (DQ139837) 、葡萄 (NM-001281160) 、茶树 (EF205148) 、西洋梨 (DQ251190) 、草莓 (JX134096) 、大豆 (JF433916) 、玫瑰 (KP768080) 作为研究对象。1.2
10、方法(1) 不同植物 LAR 核苷酸与氨基酸序列分析与比对采用 DNAStar、Clustal X2和 genedoc 软件; (2) 蛋白分子量、等电点、半衰期和稳定性等重要理化性质分析采用 Prot Param; (3) 蛋白质亚细胞定位、分泌信号肽等采用 Target P和 Signal P 4.0, 二级结构预测采用 SOPMA; (4) 蛋白质糖基化采用 Net NGlyc 在线分析, 脂酰化、磷酸化、c AMP 和 c GMP 依赖蛋白激酶磷酸化位点采用 Motif Scan; (5) 多重序列比对和构建系统发育树采用 Clustal X 2.0 和Tree View。2 结果与分
11、析2.1 LAR 基因与氨基酸序列理化性质分析利用 DNAStar 和 Prot Param 在线分析, 结果如表 1 所示, 9 种植物 LAR 基因的ORF 全长在 10291176bp 之间, GC 含量适中 (除玉米外) , 其氨基酸数目在342391, 分子量 36.9243.30 k D, p I 值在 5.166.38, 说明 LAR 呈酸性, 与酸碱氨基酸比例结果一致。经 Pro Param 分析氨基酸组成, 发现氨基酸 Va 在所有植物 LAR 中含量较高, 比例在 7.1%9.9%;氨基酸 Ile、Ala 在大多数植物LAR 中含量较高;氨基酸 Trp 和 Gln 在所有植
12、物 LAR 中含量较低。所有植物 LAR蛋白质中负电荷氨基酸残基比例高于正电荷氨基酸残基比例, 疏水氨基酸比例高于酸性、碱性和极性氨基酸比例, LAR 在溶液中的不稳定指数为 28.8649.28, 除苦荞外均低于阀值 (40 为稳定蛋白) , 推测 LAR 为稳定蛋白。脂肪系数为89.2396.88, 亲水性平均系数为-0.2580.036, 说明 LAR 蛋白质总体亲水性较低。表 1 9 种植物中 LAR 核苷酸及氨基酸序列组成和理化性质 下载原表 2.2 LAR 氨基酸序列比对分析不同植物的 LAR 氨基酸序列经 Clustal X 2.0 比对后, 除了玉米, 其他植物的LAR 氨基酸
13、序列同源性较高, 都存在 RFLP、ICCN 和 THD 结构域 (图 1) , 推断不同植物中 LAR 的活性差异可能与保守结构域中个别氨基酸的替换相关。2.3 LAR 翻译后修饰与功能位点分析植物蛋白质序列分析对其生物学功能的确定具有重要意义。9 种植物蛋白质翻译后修饰位点表明 (表 2) , 通过 Net NGlyc 在线 N-糖基化位点分析, 玉米、葡萄、茶树和玫瑰 4 种植物的 LAR 蛋白含有不同的糖基化位点 (玉米270NNTV、葡萄 227NKSL、茶树 50NKTL 和 212NKSV、玫瑰 229NLSD) , 说明这些蛋白质只能在真核生物中翻译才具有生物学功能。通过 Mo
14、tif Scan 预测 c AMP和 c GMP 依赖蛋白激酶、脂酰化等, 所有植物 LAR 蛋白都具有蛋白激酶 C 磷酸化位点、酪蛋白激酶磷酸化位点和 N 端肉豆蔻酰化位点, 而酪氨酸激酶磷酸化位点的修饰唯有玉米 LAR 蛋白含有, c AMP 和 c GMP 依赖蛋白激酶磷酸化唯有苦荞蛋白序列 (343KKQS 和 361KKRS) 和大豆蛋白序列 (355KKCS) 位点修饰。2.4 蛋白的亚细胞定位和二级结构预测与分析Target P 在线分析表明 (表 3) , 信号肽预测分值为 0.0120.618, cutoff 值为 0.430, 说明 9 种植物 LAR 蛋白不存在信号肽,
15、其结果与 Signal P 4.0 预测的结果相符;亚细胞定位分析表明, 线粒体定位预测值为 0.0710.652, 定位于其他位置的预测值为 0.0580.548;经 SOPMA 对 LAR 进行二级结构预测, 预测结果表明 (表 3) , 不同植物 LAR 二级结构 螺旋所占比例为 30.39%43.73%, 折叠所占比例为 8.16%11.11%, 无规则卷曲所占比例为 29.26%38.00%, 延伸链所占比例为 16.91%24.85%, 说明 LAR 蛋白的二级结构以 螺旋和无规则卷曲为主。图 1 多重氨基酸序列比对结果 下载原图黑色和灰色分别表示氨基酸的相似性;方框标明保守结构域
16、。物种名分别为 Gm LAR:大豆 (Glycine max) ;Cs LAR:茶树 (Camellia sinensis) ;Pc LAR:西洋梨 (Pyrus communis) ;Md LAR:苹果 (Malus X domestica) ;Fa LAR:草莓 (Fragaria x ananassa) ;Rr LAR:玫瑰 (Rosa rugosa) ;Ft LAR:苦荞 (Fagopyrum tataricum) ;Vv LAR:葡萄 (Vitis vinifera) ;Ze LAR:玉米 (Zea) 。2.5 进化分析利用 Clustal X 2.0 和 Tree View 对不同植物的 LAR 进行氨基酸的进化分析, 结果表明 (图 2) , 不同植物 LAR 在进化过程中, 禾本科的玉米 LAR 与其他科植物 LAR 距离较远, 亲缘性较远;蔷薇科的西洋梨、苹果、草莓和玫瑰
