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1、一悬浮细胞 MTT 实验时,由于离心弃上清会造成一定程度的细胞丢失,而且操作又麻烦.请教各位老师,不用弃上清的 SDS-DMF,酸化异丙醇的方法的具体步骤和参考文献.谢谢!1介绍一种巨噬细胞杀伤活性的 MTT 检测：于 24 孔培养板中加入 1109/L 腹腔巨噬细胞(1ml/孔) ，培养 2h 后洗去未贴壁细胞，加入不同浓度的 MDP。收集对数生长期的UMR106 细胞，调整细胞浓度至 1108/L，加入各孔，效靶比（E/T ）为 10:1，再培养24h，充分振荡。每孔取 100l 的 UMR106 细胞移入 96 孔培养板，各孔加入5g/LMTT20l，培养 4h，再加入 10SDS100
2、l ，测定 570nm 处的 A 值。计算公式如下：杀伤活性（）=(1实验组 UMR106 细胞的 A 值/ 对照组 UMR106 细胞的 A 值)100本方法参考文献，Jiao H, Shan WM, Ohe Y, et al. A new MTT assay for testing macrophage cytotoxicity to L1210 and its drug resistant cell lines in vitro. Cancer Immunol Immunother,1992;35:412 4162SRB 是一种活性蛋白染料，能与细胞蛋白的碱性氨基酸结合而显色，在 490
3、nm520nm波长处其 OD 值与活细胞数成良好的直线关系。SRB 法已被 NCI 选定作为筛选抗癌药物的新方法，相对于结晶紫法或目前普遍采用的 MTT 法，其灵敏度好于结晶紫法，相当或优于 MTT 法。除此之外 SRB 法还有以下优点： (1) 操作时间短，细胞固定和染色仅需 90分钟左右，而 MTT 加样后还需培养 4 小时。(2)没有严格时间限制，在 TCA 固定后或 SRB结合后的细胞均可存放，Monks 指出样品保存 7 天，测定的 OD 值下降不超过 28 。（3）可以测定悬浮细胞，采用 16% 的三氯乙酸直接加入培养细胞中能完整酸化固定细胞，较之 MTT 法或结晶紫法离心取上清的
4、操作，不会带来细胞损失，测定结果更准确。要用 MTT 法，可以选用无酚红的无色培养基，离心吸取部分上清，不要吸走底部细胞和formazan,剩下部分放烤箱烘干。就不会影响你的测定了。二悬浮肿瘤细胞 MTT 法检测细胞生长抑制率时采用的细胞裂解液配方及如何配制1细胞种于 96 孔板中，6 小时左右后，加入受试药物,继续培养 72 小时后加入 20 ul 5mg/ml 的 MTT，37温育 4 小时，加入 100 ul 三联液（10SDS5异丙醇12mMHCl） ，温育 1220 小时，用平板读数计在 570nm 处测定每孔的光密度值（OD 值）.细胞增殖生长抑制率和增效率分别按公式计算2检测悬浮
5、细胞生长抑制率用 CCK-8 试剂比较好，操作比较简单，误差比较小。三悬浮细胞，何时加药物？细胞接种孔板时？1一般文献报道的方法，是贴壁细胞在细胞贴壁后加药物（一般为上板后 24h） ，而悬浮细胞是上板同时加。 但是，我个人的经验，药物加的时机并不是固定的，具体要根据你实验本身的要检测的指标。如果你要做有关细胞增殖的药物，加药的时机影响不大，主要是药物的作用时间起决定性因素。但是，如果你要检测的是其他一些指标，比如，如果你想做药物对细胞黏附功能的影响，可能就要在细胞贴壁 以前就要加药了。2贴壁细胞一般在试验前 1-2 日接入孔板， 太晚，细胞在传代后有一个小时左右的停滞期，此时代谢变慢，增殖缓
6、慢，及对数曲线的底部，此时的 MTT 数值太低了， 太早了，实验时候，细胞生长过头，此时有死亡和凋亡的细胞，实验时本底又过高， 让试验时落在对数早中期最好四悬浮细胞如何做 mtt?1一种方法加 MTT， 孵育，离心，去上清，每孔加入 DMSO。振荡 10 分钟后选择波长，测 OD 值；这种方法较麻烦，尤其是没有平板离心机的情况下。另一种方法是酸化异丙醇法：细胞悬液离心，弃上清，加 MTT，孵育，加入酸化异丙醇，离心，取上清测 OD 值。后者推荐使用。2悬浮细胞可以用 EP 管离心，但是，一般悬浮细胞是养在培养板里的，如果你再把悬浮细胞转到 EP 管里，再离心，会很累的。最好用平板离心机离心，如
7、果没有，只能转到 EP管里再离了。但是，转来转去的，会丢失细胞不说，还有可能影响到细胞的活力。DMSO 和酸化异丙醇原理应当差不多，活细胞内线粒体脱氢酶能将四氮唑化物（MTT）由黄色还原为兰色的甲赞,后者溶于有机溶剂（二甲基亚枫、酸化异丙醇）,甲赞产量与细胞活性成正比。可用酶标仪测定其 OD 值。3异丙醇中加入 HCl 配成 0.04mol/L。不同的时间加入不同的药物，你可以使用可拆式细胞培养板呀。一般实验你要做几个复孔的，所以，一个板子，有的时候显得还不够用呢。你还可以用二十四孔板，六孔板呀。多买几个板子，同时培养，但是在不同的时间处理。比如二十四小时的时候拿出一个来做 MTT。再过二十四
8、小时，第二个板子就已经培养了四十八小时，你再拿出来做 MTT。五SDS 方法：用 0.01N HCL 溶解 SDS（要求纯度要高，sigma 的最好） ，10；加入 MTT 继续培养 4 小时，96 孔培养板不用离心，直接加入 100ul孔（培养量为 100ul 孔） ，置 CO2 培养箱过夜，直接测定。溶液颜色很稳定，72 小时内变化不大。六S180 细胞是悬浮的，能否用 MTT 测定 OD 值？1可以用 MTT 测定 OD 值的。具体方法如下：细胞种于 96 孔板中，6 小时左右后，加入受试药物,继续培养 72 小时后加入 20 ul 5mg/ml 的 MTT，37温育 4 小时，加入 1
9、00 ul 三联液（10SDS5异丙醇12mMHCl） ，温育 1220 小时，用平板读数计在 570nm 处测定每孔的光密度值（OD 值）.细胞增殖生长抑制率和增效率分别按公式计算。 （吸取上清后，我用 DMSO 与细胞混匀后作用 5-10 分钟。570nm 的波长。一般不用三联液的。 ）2tedzh wrote:可以。具体方法如下：1.细胞种于 96 孔板中，加入受试药物。2.继续培养至所需要的时间。3.10ul10mg/ml 的 MTT，1200rpm,5min.4.37、5%CO2、饱和湿度温育 4 小时。5.4000rpm,10min6.倒板去上清。7.加入 DMSO 振荡反应 10
10、MIN8.测 A570七我在做药物对细胞的影响，细胞是 K562，现在要做 MTT,在加 MTT 之前，是不是一定要把药物洗掉？因为是悬浮细胞，怎么洗？洗会不会对细胞数有影响？1贴壁细胞也没有说还要洗掉药物的，但是在加入 DMSO 之前，实际上还是把培养液给吸掉了，而药物就溶解在培养液里头。如果你的悬浮细胞 MTT 法最后是通过 离心后去上清,加 DMSO 溶解结晶的方法来检测的话，实际上你还是洗掉了药物的干扰了。如果刻意地“离心弃上清液加 MTT”，或者“离心 弃上清液培养液重悬离心弃上清液加 MTT”，往往得不偿失，会在瓶壁上/或者操作过程中损失掉一些细胞的，影响实验结果。2也有人说当体积
11、小于一百微升时可以直接加 MTT,如果不影响结果的话。还要看你的药物和 MTT 有没有反应。八mtt 原理和方法：1MTT 法的原理是：包括肿瘤细胞在内的有核细胞线粒体呼吸链上的琥珀酸脱氢酶能把3-(4，5)-2-噻唑-(2，5)- 二苯基溴化四氮唑蓝(MTT) 还原成蓝色的甲2MTT 法测细胞相对数和相对活力活细胞中的琥珀酸脱氢酶可使 MTT 分解产生兰色结晶状甲赞颗粒积于细胞内和细胞周围。其量与细胞数呈正比，也与细胞活力呈正比。l1：接种细胞：用含 10胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔100010000 个细胞接种到 96 孔板，每孔体积 100 或 200ul.2:培养细胞：同
12、一般培养条件，培养 24-48 小时3：加入受试药物，一般 5-7 个浓度，每个浓度 3 个复孔，同时设空白对照，不加药物的阴性对照和阳性对照。.4：呈色：培养 24-48 小时后，每孔加 MTT 溶液（5mg/ml 用 PBS 配)20ul.继续孵育 4 小时，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加 100ul DMSO，振荡 10 分钟，使结晶物充分融解。5：比色：选择 490nm 或 570nm 波长，在酶标仪上测定各孔光吸收值注意事项：（1）选择适当得细胞接种浓度。（2）注意：MTT 法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测定细胞绝对数。（3
13、）若药物与 MTT 能够反应，第四步时可以先离心后弃去培养液，小心用 PBS 冲 2-3 遍后，再加入含 MTT 的培养液。九上面的回复都是从书上抄的，我第一次做时，就按书上的做，就见不到 formasan 形成，第二次我把细胞加大到 200000/ml, MTT 反应时间加至 5 小时才出结果，所以要看自己的细胞决定具体试验条件。另外关于选择 490nm 或 570nm 波长，如果用二甲亚砜中止反应，用 492nm；如用酸化异丙醇，用 570nm。附上我做 MTT 是查的资料，希望有用用 MTT 比色法测定细胞增殖活性，取对数生长期细胞,以不同浓度加入 96 孔板,细胞浓度从高到低每孔依次为
14、 28104,14104,7104,3.5104,1.75104,0.825104,0.412104,0.206 104,0.103104,每孔 100l,置于 37,5%CO2 、饱和湿度条件下孵育一定时间（分别做出培养 1，2，3，4 天的板子）,然后在反应板中加入 MTT(5 mg/ ml) ,每孔 10l 或 20l,同上条件继续培养 4h,离心,去上清。各孔加入二甲基亚砜(DMSO)或 10%SDS100l,溶解 MTT 还原产物,微型震荡器震荡 5min 后,室温放置 0.5h 分别用全自动酶标仪测定 492nm 波长吸光度(A)值。结果如下图：（摘自MTT 比色法的条件探讨方蓉,
15、李芳秋等 临床检验杂志2003 年第 21 卷第 1 期Chinese Journal of Clinical Laboratory Science ,2003 ,Vol121 ,No11） 。MTT 体外药敏实验：细胞：取指数生长期细胞进行实验，细胞接种密度可查阅相关文献.试剂： 药物工作液（终浓度）：连续 10 倍稀释的 5 个浓度,如30，3，0.3，0.03，0.003 MTT 溶液：临用前用生理盐水溶解，60水浴助溶，浓度为 5mg/ml。三联溶解液：SDS 10g异丁醇 5ml10M HCl 0.1ml用双蒸水溶解配成 100ml 溶液细胞接种与加药：将一定密度的肿瘤细胞 90l/
16、孔接种于 96 孔微量培养板内,然后加入药液 10l/孔,每种药 5个浓度(每个浓度相差 10 倍),一个浓度设 4 个复孔。每块板设一个空白调零孔 ,内加细胞培养液 100l，不含细胞与药物。每种细胞设 6 个正常对照孔,加样 100l/孔(即有肿瘤细胞的培养液)，不含药物。接种完毕后在 37， 5%CO2 条件下孵育培养 48 小时。1 加 MTT：加 MTT 溶液(5mg/ml)20l/孔 ,混匀后 37，5%CO2 条件下孵育 4 小时。2 加三联液：加溶解三联液 100l/孔，混匀后 37放置过夜以溶解甲臢。3 吸光度（A）测定：测定波长为 570nm，校正波长为 630nm。96 孔板附图于附件 ppt 文件.D药物，为正常对照，为空白调零孔 以下的 protocol 供参考：1. Make a solu
