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1、正交设计优选益脾软肝丸最佳醇提工艺 高松 朱志军 邓浩 李莹丽 张楠楠 蒋亚超 李素领 河南中医药大学 河南中医药大学第一附属医院 摘 要： 目的:优选益脾软肝丸的醇提工艺。方法:采用正交试验设计, 以阿魏酸、绿原酸提取量和浸膏得率的综合评分为指标, 考察乙醇体积分数、乙醇用量、提取时间和提取次数对醇提工艺条件的影响。结果:最佳提取工艺为加 8 倍量体积分数 80%乙醇回流提取 3 次, 每次 1.5 h。结论:优选工艺科学合理, 可作为该制剂合理开发的依据。关键词： 益脾软肝丸; 正交试验; 醇提工艺; 中药; 作者简介：高松 (1990-) , 男, 河南商丘人, 硕士研究生, 研究方向:
2、制剂技术与新药研究。作者简介：朱志军 (1962-) , 男, 医学硕士, 副主任药师, 硕士研究生导师。Email:基金：河南省科技攻关计划项目 (201210471040) Optimization of Ethanol Extraction Process for Yipi Ruangan Pill with Orthogonal TestGAO Song ZHU Zhijun DENG Hao LI Yingli ZHANG Nannan JIANG Yachao LI Suling Henan University of Chinese Medicine; The First Aff
3、iliated Hospital of Henan University of Chinese Medicine; Abstract： Objective: To optimize ethanol extraction process of Yipi Ruangan pill. Methods: Orthogonal test was adopted to investigate effects of the amount of ethanol and ethanol concentration, extraction time, extraction times on ethanol ext
4、raction process with composite score of yield of ferulic acid, chlorogenic acid and dry extract as index. Results: Optimal extraction conditions were as follows: reflux extracted 3 times with 8 folds the amount of 80% ethanol, 1. 5 h per time. Conclusion: Optimized ethanol extraction process is cien
5、tific and reasonable, can be used as the basis for reasonable development of the preparation.Keyword： Yipi Ruangan pill; orthogonal experiment; ethanol extraction process; Chinese medicine; 益脾软肝丸是河南中医药大学第一附属医院李普主任医师临床工作 40 余年总结出的综合治疗肝纤维化的有效方药, 由当归、柴胡、茵陈、金银花、郁金、鳖甲、茯苓、白术等组成。临床实践表明, 该方对肝纤维化有良好的防治作用, 现代
6、药理研究表明金银花和茵陈的共同成分绿原酸具有保肝利胆、抗肿瘤、抗菌消炎、抗病毒、增高白血球、降血压、延缓衰老及兴奋中枢神经系统等多种药理作用1-3。当归的主要成分阿魏酸有很好的抗氧化活性, 抗肝损伤、调节免疫、降血脂和改善动脉粥样硬化、抗血栓及抗心肌缺血4。本研究建立高效液相色谱法同时测定阿魏酸和绿原酸含量的方法, 采用正交试验法, 以阿魏酸、绿原酸提取量及出膏率为考察指标, 对益脾软肝丸的醇提工艺进行研究, 为益脾软肝丸制备工艺提供实验依据。1 材料Waterse2695 高效液相色谱仪, 2696 紫外检测器 (美国沃特斯公司) ;华普Unitary C18柱 (4.6 mm250 mm,
7、 5m) (华普新创科技有限公司) ;METTLERAE240 十万分之一天平 (德国梅特勒公司) ;SHZ-D () 循环水式真空泵 (英峪予华) ;PTHW 型调温电热套 (巩义市英峪予华电热仪器厂) ;DZKW-4型电子恒温水浴锅 (北京中兴伟业仪器有限公司) ;KQ-100 型超声波清洗器 (昆山市超声仪器有限公司) , RE52-99 旋转蒸发仪 (上海亚荣生化仪器厂) ;优普 UPH 系列超纯水机 (四川优普超纯科技有限公司) 。乙腈 (色谱纯, 天津四友精细化学品) ;水为超纯水, 其他试剂均为分析纯;当归、茵陈、金银花、郁金均购自张仲景大药房, 经河南中医药大学生药教研室董诚明
8、教授鉴定均为正品;绿原酸批号:090330, 阿魏酸批号:141029, 均购自中国药品生物制品检定所。2 方法与结果2.1 阿魏酸与绿原酸高效液相色谱法检测2.1.1 色谱条件以 Unitary C18色谱柱 (4.6 mm250 mm) ;以乙腈为流动相 A, 以体积分数 0.1%磷酸水为流动相 B, 进行梯度洗脱 (见表 1) ;检测波长为 327 nm, 流速 1.0 m Lmin, 柱温 35, 进样 20L。表 1 高效液相色谱法洗脱进度表 下载原表 2.1.2 对照品溶液的制备分别取干燥的绿原酸和阿魏酸对照品适量, 精密称定, 置棕色容量瓶中, 加体积分数 70%甲醇制成每 1
9、m L 含绿原酸 281.00g、阿魏酸 11.15g 的混合对照品溶液, 摇匀, 即得。2.1.3 供试品溶液的制备将提取液旋蒸回收溶剂, 浓缩至无醇味定容于 100 m L 容量瓶中, 精密量取 10 m L, 置 25 m L 棕色容量瓶中, 加体积分数 70%甲醇至刻度, 摇匀, 0.45m 微孔滤膜过滤, 即得。2.1.4 阴性样品溶液按处方比例分别制备不含当归和不含茵陈、金银花的 2 份阴性对照样品, 按供试品溶液的制备方法制成阴性对照溶液。2.1.5 专属性实验取对照品溶液、供试品溶液和阴性样品溶液, 按 2.1.1 项下色谱条件分别进样分析, 每次进样 10L。结果供试品溶液色
10、谱图中, 阿魏酸和绿原酸对照品色谱相同的保留时间处有色谱峰, 与其他组分能达到基线分离, 分离度1.5;阴性对照色谱中, 在与绿原酸和阿魏酸对照品色谱峰相应的位置上无干扰峰, 说明供试品溶液的其他成分对测定结果无影响, 见图 1-图 6。图 1 绿原酸对照品色谱图 下载原图注:1 绿原酸图 2 阿魏酸对照品色谱图 下载原图注:2 阿魏酶图 3 绿原酸、阿魏酸混合对照品色谱图 下载原图注:1 绿原酸;2 阿魏酸图 4 当归阴性色谱图 下载原图注:1 绿原酸2.1.6 线性关系考察分别精密吸取绿原酸阿魏酸混合对照品溶液 2L, 5L, 10L, 15L, 20L, 25L, 30L 进样, 按 2
11、.1.1 项下色谱条件测定。以测得的绿原酸和阿魏酸峰面积为纵坐标, 以进样量为横坐标, 分别绘制标准曲线, 结果见表2。图 5 茵陈、金银花阴性色谱图 下载原图注:2 阿魏酸图 6 供试品色谱图 下载原图注:1.绿原酸;2.阿魏酸表 2 线性关系 下载原表 2.1.7 精密度实验精密吸取混合对照品溶液 10L 进样, 重复 6 次, 分别测定其面积, 结果绿原酸 RSD 为 0.536 7 (n=6) , 阿魏酸 RSD 为 0.434 9 (n=6) 。2.1.8 重复性实验分别精密吸取 2.1.3 项下的同一样品溶液, 按 2.1.1 项下色谱条件测定, 结果绿原酸 RSD 为 0.166
12、 7 (n=6) , 阿魏酸 RSD 为 0.505 9 (n=6) 。2.1.9 稳定性实验取同一样品溶液分别在 0 h, 2h, 4 h, 8 h, 12 h 内, 按 2.1.1 项下色谱条件测定, 结果绿原酸 RSD 0.87% (n=5) , 阿魏酸 RSD, 1.09% (n=5) , 表明稳定性良好。2.1.1 0 加样回收率实验精密吸取益脾软肝丸醇提第 2 组正交样品 6 份, 各准确加入相同量的绿原酸和阿魏酸对照品适量, 按照 2.1.3 项下方法操作, 按 2.1.1 项下色谱条件进样分析, 计算绿原酸的平均加样回收率为 100.00%, RSD 为 1.79% (n=6)
13、 ;阿魏酸的平均加样回收率为 99.08%, RSD 为 1.77% (n=6) , 表明该方法回收率良好。2.1.1 1 样品含量测定分别精密量取对照品混合溶液和 19 供试品溶液 10L 按 2.1.1 项下色谱条件进样, 计算样品中所含的阿魏酸和绿原酸含量 (n=3) 。2.2 干浸膏得率的测定精密量取各提取液 20m L, 置已干燥至恒质量的蒸发皿中, 水浴蒸干后, 于105干燥 3 h, 移于干燥器中冷却 30 min, 迅速精密称定质量, 计算干浸膏得率。2.3 正交试验设计益脾软肝丸处方由当归、柴胡、茵陈、金银花、郁金、鳖甲、茯苓、白术等组成, 根据各味药材所含与保肝护肝药理作用
14、有关的主要成分的理化性质、生理活性, 结合剂型特点及生产工艺的实际5-6, 确定了将当归、茵陈、金银花和郁金进行乙醇提取, 乙醇提取的处方量为当归 20 g, 茵陈 40 g, 金银花 20 g, 郁金 15 g。考虑到本次实验中影响醇回流提取效果的主要因素有乙醇体积分数, 溶剂用量, 提取时间和提取次数, 所以选择此 4 因素进行 3 水平正交试验, 以绿原酸 (W 1) 和阿魏酸 (W 2) 的提取量及干浸膏量 (W 3) 为指标考察, 权重系数依次为 0.4, 0.4, 0.2, 综合评分= (0.4W 1/W1max+0.4W2/W2max+0.2W3/W3max) 100%。因素水平
15、表见表 3, 实验安排及结果见表 4, 方差分析见表 5。表 3 益脾软肝丸醇提工艺正交试验因素水平 下载原表 表 4 益脾软肝丸醇提工艺优选正交实验安排 下载原表 表 4 综合评分方差分析 下载原表 结果表明, 各因素对醇提工艺的影响程度依次为 CABD。方差分析表明因素C 具有显著性影响, 其他因素无显著性差异, 结合实际生产最终确定益脾软肝丸的醇提最佳工艺为 A2B2C3, 即加 8 倍量体积分数 80%乙醇回流提取 3 次, 每次 1.5 h。2.5 验证实验按处方量称取醇提药材 3 份, 加 8 倍量体积分数 80%乙醇, 回流提取 3 次, 每次 1.5h, 分别测得绿原酸提取量依
16、次为 7.826 mgg, 7.835 mgg, 7.831 mgg, 阿魏酸提取量依次为 0.153 mgg, 0.156 mgg, 0.160 mgg, 干浸膏率依次为 27.6%, 27.3%, 27.1%。结果表明, 用优选的工艺条件提取, 阿魏酸和绿原酸含量及干浸膏率均较高, 且稳定。3 讨论处方中茵陈和金银花中都含绿原酸, 且作为此两味药材的含量指标7, 故选择提取液中总的绿原酸含量作为醇提工艺的一个考察指标, 这样根据绿原酸提取量同时考察茵陈和金银花提取效果。色谱条件的选择, 待测成分的最大吸收波长不同, 中华人民共和国药典在当归中阿魏酸的含量测定选择波长为 316 nm, 茵陈和金银花绿原酸含量测定选择波长为 327 nm, 通过预实验比较两种成分在 316 nm 和 327 nm 都有吸收, 但在 327 nm 分离度和峰型更好,
