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1、HPLC 法同时测定四黄止痛喷雾剂中黄芩苷、小檗碱和大黄素的含量 李辉标 陈慕媛 丘振文 李得堂 唐洪梅 广州中医药大学第一附属医院 摘 要： 目的:建立同时测定四黄止痛喷雾剂中 3 种有效成分黄芩苷、小檗碱与大黄素的含量的 HPLC 法。方法:采用安捷伦 ZORBAX SB-Aq 色谱柱 (4.6 mm250 mm, 5m) , 流动相为乙腈 (A) -0.05 mol/L 磷酸二氢钾溶液 (用磷酸调节 p H 至3.0) (B) , 采用梯度洗脱 (0 9 min, 24%A;910 min, 24%A29%A;10 20 min, 29%A;2022 min, 29%A63%A;22 3
2、2 min, 63%A) , 流速为 1.0 m L/min, 柱温为30, 检测波长分别为 280 nm (黄芩苷) , 265 nm (盐酸小檗碱) , 254 nm (大黄素) 。结果:黄芩苷、盐酸小檗碱和大黄素进样量分别在 0.59072.9536g (r=0.9999) , 0.30461.5232g (r=1) , 0.01444 0.0722g (r=1) 范围内线性关系良好;加样回收率 (n=6) 分别为 99.86%、100.84%和 99.66%, RSD 分别为 1.24%、1.97%和 1.35%。结论:本法适用于同时测定四黄止痛喷雾剂中黄芩苷、盐酸小檗碱和大黄素的含量
3、。结论:该方法简便、准确、重复性好, 可为制定四黄止痛喷雾剂质量标准及产品质量控制提供依据。关键词： 四黄止痛喷雾剂; 黄芩苷; 盐酸小檗碱; 大黄素; 高效液相色谱; 质量标准提升; 作者简介：李辉标 (1986-) , 男, 广东梅州人, 主管药师, 硕士, 研究方向:中药新药开发与安全性评价。作者简介：唐洪梅 (1970-) , 女, 广西桂林人, 教授, 博士, 研究方向:中药新药开发与安全性评价, E-mail:。基金：广东省临床用药研究基金 (2015ZT10) Simultaneous Determination of Baicalin, Berberine Hydrochlor
4、ide and Emodin in Sihuang Zhitong Spray by HPLCLI Huibiao CHEN Muyuan QIU Zhenwen LI Detang TANG Hongmei The First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine; Abstract： Objective: To develop an HPLC method for simultaneous determination of baicalin, berberine hydrochloride and e
5、modin in Sihuang Zhitong Spray. Methods: The analysis was performed on an Aglient ZORBAX SB-Aq column ( 4. 6 mm 250 mm, 5 m) with gradient elution ( 0-9 min, 24% A; 9-10 min, 24% A29% A; 10-20 min, 29% A; 20-22 min, 29% A63% A; 22-32 min, 63% A) by using the mobile phase of acetonitrile ( A) -0. 05
6、mol/L potassium dihydrogen phosphate solution ( with phosphoric acid to adjust p H = 3. 0) ( B) . The flow ratewas 1. 0 m L/min and the column temperature was maintained at30 . The detection wavelengths were set at 280 nm ( for baicalin) , 265 nm ( for berberine hy-drochloride) and 254 nm ( for emod
7、in) , respectively. Results: The calibration curves were linear within the range of 0. 5907-2. 9536 g ( r = 0. 9999) for baicalin, 0. 3046-1. 5232 g ( r = 1) for berberine hydrochloride, 0. 01444-0. 0722 g ( r = 1) for emodin, respectively, and the average recoveries were 99. 86% ( RSD = 1. 24%) , 1
8、00. 84% ( RSD = 1. 97%) and 99. 66% ( RSD = 1. 35%) , respectively. Conclusion:The established method is simple and quick, and can be used for simultaneous determination of baicalin, berberine hydrochloride and emodin in Sihuang Zhitong Spray.Keyword： Sihuang Zhitong Spray; baicalin; berberine hydro
9、chloride; emodin; HPLC; improvement of quality standard; 四黄止痛喷雾剂是课题组正在研发的新制剂, 源于明代王肯堂证治准绳, 由黄连、黄柏、黄芩、大黄等药味组成, 具有活血祛瘀, 通络消肿止痛之功。在全国众多医院被广泛应用于骨折1、腰扭伤2、疼痛3、创面感染4、皮下血肿5、盆腔炎6-8、急性胆囊炎9、静脉炎10-11以及急性痛风性关节炎12等疾病的治疗。为了有效控制该制剂的质量, 本研究采用 HPLC 法同时测定该制剂中黄芩苷、盐酸小檗碱、大黄素的含量, 实验结果表明本法简便、快捷、准确, 可作为该制剂的质量控制标准。1 仪器与材料HP1
10、100 型高效液相色谱仪, 美国安捷伦公司;XA-105 型十万分之一电子天平, 瑞士 Mettler Toledo 公司;New Classic MF 型千分之一电子天平, 瑞士Mettler Toledo 公司) ;HWS24 型电热恒温水浴锅, 上海一恒科技有限公司;KQ-100KDE 型超声仪, 昆山市超声仪器有限公司;RE-2000 型旋转蒸发仪, 上海亚荣生化仪器厂。黄连, 批号:150601, 黄柏, 批号:150601, 黄芩, 批号:150601, 均购于广州岭南药业有限公司;大黄, 批号:150412391, 广东省康美药业有限公司, 经检验均合格。黄芩苷对照品 (批号:1
11、10715201318, 纯度 93.3%) 为供含量测定所用, 购于中国食品药品检定研究院;盐酸小檗碱对照品 (批号:110713200910, 纯度97.9%) 为供含量测定所用, 购于中国药品生物制品检定所;大黄素对照品 (批号:110756200110, 纯度 100%) 为供含量测定所用, 购于中国药品生物制品检定所;乙腈 (色谱纯, 德国默克公司) , 水为重蒸馏水, 其余试剂均为分析纯。2 方法与结果2.1 色谱条件2色谱柱为安捷伦 ZORBAX SB-Aq (4.6 mm250 mm, 5m) , 流动相为乙腈 (A) -0.05mol/L 磷酸二氢钾溶液 (用磷酸调节 p H
12、 至 3.0) (B) , 梯度洗脱 (09 min, 24%A;910 min, 24%A29%A;1020 min, 29%A;2022 min, 29%A63%A;2232 min, 63%A) , 流速 1.0 m L/min, 柱温为 30, 检测波长分别为 280 nm (黄芩苷) , 265 nm (盐酸小檗碱) , 254 nm (大黄素) ;进样量:5L。2.2 混合对照品溶液的制备精密称取黄芩苷、盐酸小檗碱和大黄素对照品适量, 用甲醇制成含黄芩苷295.36g/m L、盐酸小檗碱 152.32g/m L、大黄素 7.22g/m L 的混合对照品溶液, 备用。2.3 供试品溶
13、液制备精密量取四黄止痛喷雾剂 110 m L 容量瓶中, 加入甲醇定容至刻度, 密塞, 摇匀, 0.45m 微孔滤膜滤过, 取续滤液, 即得供试品溶液, 备用。2.4 阴性样品溶液按四黄止痛喷雾剂处方比例与制备工艺, 分别制备缺黄连与黄柏、缺黄芩和缺大黄阴性样品, 按 2.3 项下方法制备各阴性样品溶液。2.5 专属性试验分别取对照品混合溶液、供试品溶液及各阴性样品溶液, 按 2.1 项下色谱条件进行分析, 记录色谱图, 在 254 nm 处检测的色谱图见图 1。在样品色谱图中, 分别有与对照品黄芩苷、盐酸小檗碱和大黄素保留时间一致的特征峰, 保留时间分别为 8.5 min、20.7 min
14、和 27.6 min, 对称良好, 分离度均大于 1.5, 各阴性样品色谱图中无相应特征峰, 表明处方中其他药味对被测成分无干扰, 方法专属性良好。图 1 四黄止痛喷雾剂 HPLC 图 下载原图1.黄芩苷;2.盐酸小檗碱;3.大黄素 A.混合对照品;B.样品;C.缺黄芩的阴性样品;D.缺黄连、黄柏的阴性样品;E 缺大黄阴性样品2.6 标准曲线的制备取混合对照品溶液, 按 2.1 项下色谱条件, 分别自动进样 2、4、6、8、10L, 记录色谱图, 以进样量为横坐标, 峰面积为纵坐标绘制标准曲线。得到黄芩苷回归方程为:Y=3712.2X+79.69 (r=0.9999) , 小檗碱回归方程为:Y
15、=4261.7X-9.47 (r=1) , 大黄素回归方程为:Y=3495.8X+0.42 (r=1) , 结果表明黄芩苷在0.59072.9536g, 小檗碱在 0.30461.5232g, 大黄素在0.014440.0722g 与峰面积的线性关系良好。2.7 精密度试验取同一对照品混合溶液, 按 2.1 项下色谱条件, 连续自动进样 6 次, 记录色谱图, 连续进样 6 次, 以峰面积计算黄芩苷、盐酸小檗碱和大黄素的 RSD 分别为0.06%, 0.11%, 0.36% (n=6) 。结果表明精密度良好。2.8 重复性试验取同一批号 (批号为:20150901) 四黄止痛喷雾剂制备 6 份
16、供试品溶液, 按 2.1项下色谱条件, 分别进样, 测得峰面积并计算含量, 结果测得黄芩苷、盐酸小檗碱和大黄素峰面积 RSD 分别为 1.44%、1.50%和 1.54%, 表明重复性良好。2.9 稳定性试验取制备好的同一样品 (批号:20150901) 的供试品溶液, 室温下放置, 按 2.1 项下色谱条件, 分别于制备后 0、1、2、4、6、12、24 h 进样分析, 记录色谱图, 结果黄芩苷、盐酸小檗碱和大黄素峰面积的 RSD 分别为 1.79%、1.90%和 1.66%, 表明供试品溶液各组分在 24 h 内基本稳定。2.10 加样回收率实验精密量取已知含量的四黄止痛喷雾剂 (批号:20151001) 6 份, 每份 5 m L, 分别精密加入 5 m L 的黄芩苷、盐酸小檗碱和大黄素混合对照品, 按供试品溶液制备方法制备供试液, 进样测定, 计算回收率,
