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1、1252TG 致新的弱 D 型血清学和分子生物学研究 吴大洲 张薇薇 左琴琴 毛娟 王红 褚晓月 叶世辉 徐华 周华友 张印则 陕西省血液中心 南方医科大学南方医院 深圳市血液中心 摘 要： 目的 分析研究 1 例新的弱 D 型个体的血清学和分子生物学特点。方法 采用盐水法鉴定 Rh D/C/c/E/e 抗原, 并采用间接抗球蛋白法 (IAT) 进一步鉴定 Rh D抗原, 采用盐水法和抗人球蛋白法进行抗体筛查;采用商用基因检测试剂盒对标本进行 CDE 基因检测;对其 RHD 基因 10 个外显子序列进行测序分析比对。结果 血清学检测显示该标本为 D 变异型, RHCE 血型为 C+c+E-e+
2、, 抗体筛查为阴性。CDE 基因试剂盒检测为 DCcee, RHD 外显子序列测序分析发现第 10 外显子存在 1 252 TG 碱基突变, 其余外显子序列则与正常 RHD 基因一致。结论 该标本存在RHD1 252 TG 碱基突变, 为新的弱 D 型。关键词： Rh 血型; 弱 D 型; 血清学检测; 基因分型; 作者简介：徐华 Rh 血型系统基础与临床研究关键技术攻关合作组;作者简介：周华友 Rh 血型系统基础与临床研究关键技术攻关合作组;作者简介：张印则 (1969.10-) , 男, 医学博士, 主任技师, 主要从事输血免疫学研究, 电话:0755-25601250;EmaiL: Rh
3、 血型系统基础与临床研究关键技术攻关合作组Serology and molecular biology study of a new weak D phenotype caused by 1252TGWU Dazhou ZHANG Weiwei ZUO Qinqin MAO Juan WANG Hong CHU Xiaoyue YE Shihui XU Hua ZHOU Huayou ZHANG Yinze Shanxi BLood Center; Nanfang HospitaL , Southern MedicaL University; Shenzhen BLood Center; Ab
4、stract： Objective To analyze and study the serological and molecular biology characteristics of a new found weak D type individual. Methods Rh D, D, C, c, E and e antigen phenotypes were tested by the saline method, and the D antigen was further tested by the indirect antiglobulin test ( IAT) ; anti
5、body screening was performed using the saline method and the indirect antiglobulin test. The CDE gene detection was conducted with a commercial RBC-Ready Gene CDE kit, and then sequenced to determine the changes of the 10 RHD exons. Results The sample was confirmed RHD-variant phenotype by our serol
6、ogical tests, and the other Rh factors were C+c+E-e+ with negative antibody screening results. The CDE gene test indicated a DCcee type for the sample and the sequencing result showed a new mutation 1 252 T G at the exon 10 of the RHD gene while the other coding sequence was identical compared to no
7、rmal RHD genotypes. Conclusion This individual possesses a new weak D type caused by the mutation of RHD 1 252 TG.Keyword： Rh blood group; weak D type; serologic testing; genotyping; Rh D 血型在我国是继 ABO 血型之后血站常规检测的又一血型。Rh D 阴性人群在高加索人群中占到 15%-17%, 而在中国人群中只占到 0.3%-0.5%1, 欧美对 Rh D 血型重视程度高, 研究早, 取得一系列成果。国内
8、对其研究起步晚, 但随着我国输血要求检测 Rh D 血型, 特别是 Rh D 阴性确认试验的开展, 结合分子生物学技术, 发现了不少新的 RHD 变异体2-4。近期我们发现 1 例由于 RHD 基因1 252TG 突变导致的弱 D, 现报告如下。1 材料与方法1.1 研究对象女, 19 岁, 汉族, 西安市志愿无偿献血者, 在常规 Rh D 血型盐水法检测为 D阴性。1.2 仪器和试剂PCR 仪 (Sensoquest Labcy Le, 德国) , 台式离心机 (KA-2200 型, 日本久保田) ;台式离心机 (L600A, 湖南湘仪离心机仪器有限公司) ;水浴箱 (GFL, 德国) ;血
9、液基因组 DNA 提取离心柱型试剂盒 (天根生化科技有限公司) , Taq 酶 (上海 Promega 公司) ;RBC-Ready Gene CDE 基因检测试剂盒 (德国 Inno-Train Diagnostik 公司, 产品批号 S9CP095) ;Rh D (Ig M) 单克隆抗体试剂 (上海血液生物医药有限责任公司, 产品批号 20151812) , Rh D (Ig G) 单克隆抗体试剂 (上海血液生物医药有限责任公司, 产品批号 20151224) , Rh D (Ig M/Ig G) 抗体试剂 (美国 MILLIPORE 公司, 产品批号 BMA1502C) , C、c、E、
10、e (Ig M) 单克隆抗体试剂及抗球蛋白试剂 (上海血液生物医药有限责任公司, 产品批号分别为 20163301 和 20155001) , 抗筛细胞 (Ortho, 产品批号 3SS199) 。1.3 血清学检测按文献方法5, RH 阴性确认试验采用 2 种不同厂家 Rh D 抗体试剂以间接抗人球蛋白法进行检测, 并且做直接抗人球蛋白试验以排除假阳性, Rh C、c、E、e 采用盐水法检测, 抗体筛查采用盐水法和间接抗人球蛋白法。1.4 RHD 基因检测按照试剂说明书, 从 EDTA-K2抗凝外周血中提取基因组 DNA, 使用 RBC-Ready Gene CDE 基因检测试剂盒检测和分析
11、 RHD 和 RHCE 基因型。1.5 外显子测序为鉴定该标本 RHD 基因的外显子是否存在突变位点, 根据相关文献6设计引物, RHD 基因检测引物序列见表 1, 对 RHD 基因的 10 个外显子分别扩增后直接测序, 50L PCR 反应体系:10GC Buffer 5L, 上、下游引物各 1.5L, Taq DNA聚合酶 0.5L, 标本 DNA3L, d NTP 2L, dd H 2O36.5L。扩增条件如下:95变性 10min, 进行 35 个循环的 PCR 反应 (92、20 s, 58、30 s 和68、90 s) , 随后 72延伸 5 min, 4保存。PCR 产物送交公司
12、测序, 测序结果与 Genbank 的已知序列 (BN000065) 比较分析。表 1 检测 RHD 外显子引物序列 下载原表 2 结果2.1 血型血清学结果常规盐水法初筛 Rh D 抗原检测为阴性, 间接抗人球蛋白法 (IAT) 确认为阳性, 直接抗人球蛋白试验阴性, 证实存在有弱的 Rh D 抗原, 图 1 为标本与 2 种不同试剂 IAT 反应结果;其它 Rh 血型抗原为 C+c+E-e+, 抗体筛查盐水法和 IAT 均为阴性。2.2 CDE 基因型测定结果如图 2 所示, 1 到 8 孔均扩增出目的条带, 显示标本存在 D 基因, 13 到 16 孔未扩增出目的条带, 不属于 D、DH
13、Mi、DAU、DNB 等试剂盒说明书中所列的 D 变异型, 为 1 个特殊的 D 变异型;9、10、12 孔扩增出目的条带, 11 孔未能扩出目的条带, 即扩增出 RHCE 基因上的 C、c、e 抗原的特异性位点, 故该标本 RHCE 基因型为 Ccee, 与血清学结果一致。图 1 不同红细胞与抗-D 试剂 IAT 方法反应的血清学结果 下载原图a 为阴性对照与 Ig G-D 的反应结果;b 为阳性对照与 Ig G-D 的反应结果;c 为标本与 Ig G-D 的反应结果;d 为标本与 Ig M/Ig G-D 的反应结果图 2 CDE 基因检测结果 下载原图1 到 8 孔分别扩增 RHD 基因外
14、显子的D1、D2/D3、D4、D5/psi、D6、D7、D9、D10, 9 到 12 孔分别扩增 RHCE 基因的C/CW、c、E、e, 13 到 16 孔分别扩增D/DHMi、D/DAU、DNB/697A、DNB/697C.2.3 测序结果与 Genbank 正常 RHD 基因序列进行 BLAST 比对, 发现该标本 RHD 基因在第 10 外显子存在 1252TG 碱基的突变, 导致终止密码子 TAA 变为编码氨基酸密码子GAA, 编码谷氨酸, RHD 蛋白延长为 443 个氨基酸。图 3 正常 RHD 基因和存在突变标本第 10 外显子基因序列 下载原图(a) 为正常的 RHD 基因第
15、10 外显子, 最后三位为终止密码子 TAA; (b) 标本RHD 基因第 10 外显子部分序列, 箭头所指为基因突变位点 RHD 1 252TG; (c) 标本第 10 外显子全部序列, 箭头所指为新的终止密码子 TGA3 讨论RHD 基因位于 1 号染色体短臂上, 由 10 个外显子组成;RHD 基因编码的 Rh D 抗原贯穿红细胞膜 12 次, 分为胞外区、跨膜区和胞内区, Rh D 的抗原决定簇就位于胞外区 6 个环上。由此可区分弱 D 和部分 D, 弱 D 抗原的改变在细胞膜内和跨膜区, 细胞膜外的抗原决定簇没有改变, 所以抗原数量改变, 抗原性质没有改变;部分 D 的改变发生在膜外
16、, 抗原决定簇发生改变, 导致不仅仅抗原数量存在改变, 抗原性质也发生改变。在中国最常见的 D 变异型的 DEL 型红细胞上D 抗原位点数最少, 只有几个到几十个, 常规的血清学方法检测不出, 只有采取更敏感的吸收放散的方法才可以检测。在中国最常见的 DEL 型为 DEL1 227A, 即在 RHD 基因第 9 外显子最后 1 位存在 1 227GA 突变, 虽为同义突变, 编码氨基酸未发生改变, 但影响了 mRNA 剪辑拼接, 导致表达完整的 D 抗原表位, 但抗原表达量却显著减少7。Flegel 等8经过长期细致的研究和临床观察, 基于弱 D1、2、3 型 D 抗原改变的位置是位于红细胞膜内和膜中, 膜外的 D 抗原性质未改变, 建立了对占白色人种弱 D 型 97%的弱 D1、2、3 型输用 Rh D 阳性血的输血规则:弱 D1、2、3 型受者可以给予 D 阳性的血液。但作为国内弱 D 型的主要类型的弱 D
