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1、LC-MS 法鉴定艾滋病治疗药物去羟肌苷的有关物质 杜明荦 连莹 张军霞 陈炜 仲平 河南省食品药品检验所 摘 要： 目的:采用高效液相色谱-质谱联用技术鉴定艾滋病治疗药物去羟肌苷的有关物质结构。方法:Inert Surstain C 18 (250 mm4.6 mm, 5m) 色谱柱, 以0.386%醋酸铵溶液加氨水调节 p H 至 8.0 为流动相 A, 以甲醇-乙腈 (5050) 为流动相 B, 进行梯度洗脱, 电喷雾正离子化高分辨 TOF/MS 和 MS/MS 检测并解析有关物质结构。TOF/MS 雾化气压力 345 k Pa, 温度 350, 干燥气流量 10 Lmin-1, 毛细管
2、电压 4 k V, 碎片电压 100 V, MS/MS 测定氩气 CID 压力 0.2 Pa, 碰撞能量 25 e V。结果:检测到去羟肌苷原料中共有 8 个有关物质, 通过有机反应机制分析和质谱解析鉴定了他们的结构, 他们分别是 9- (2-氧基-丁酸) -1, 4, 5, 7, 8, 9-六氢-嘌呤-6-酮、次黄嘌呤、肌苷、2-去氧肌苷、9- (2-羟基-乙酰基) -1, 9-双氢-嘌呤-6-酮、3-去氧肌苷、2, 3-脱水肌苷、9- (2-羟乙基-4-丙酸甲酯-四氢呋喃) -1, 9-双氢-6H-嘌呤-6-酮。结论:采用色谱-质谱联用技术能有效地鉴定去羟肌苷的有关物质, 可为其质量控制研
3、究提供参考。关键词： 艾滋病治疗药物; 嘌呤核苷类药物; 去羟肌苷; 杂质鉴定; 9- (2-氧基-丁酸) -1, 4, 5, 7, 8, 9-六氢-嘌呤-6-酮; 次黄嘌呤; 肌苷; 2-去氧肌苷; 9- (2-羟基-乙酰基) -1, 9-双氢-嘌呤-6-酮; 3-去氧肌苷; 2, 3-脱水肌苷; 9- (2-羟乙基-4-丙酸甲酯-四氢呋喃) -1, 9-双氢-6H-嘌呤-6-酮; 液相色谱-质谱; 作者简介：仲平 Tel: (0371) 65566054;E-mail:作者简介：杜明荦 Tel: (0371) 65566054;E-mail:收稿日期：2016 年 12 月 21 日基金：
4、全球基金资助项目 (No.GF2012-14) LC-MS identification of the degradation products of didanosineDU Ming-luo LIAN Ying ZHANG Jun-xia CHEN Wei ZHONG Ping Henan Institute for Food and Drug Control; Abstract： Objective:To identify the related substances of didanosine by hyphenated LC-MS methods.Methods:The separa
5、tion was carried out on Inert Surstain C18 (250 mm4.6 mm, 5m) column with mobile phase consisting of0.386%ammonium acetate solution (adjust p H=8.0 by amonia water solution) and methanol-acetonitrile (5050) by gradient elution.The related substances were detected by positive ESI high resolution TOF/
6、MS and their MS/MS spectra were determined as well.The conditions of TOF/MS were as follows:nebulizer pressure 345 k Pa, gas temperature 350, drying gas flow 10 Lmin -1, capillary voltage 4 k V and fragmentor100 V.The argon collision gas pressure of MS/MS was set at 0.2 Pa, and the collision energy
7、at 25 e V.Results:There were 8 related substances in didanosine and their chemical structures were determined through the elucidation of their accurate TOF/MS data, the corresponding product MS spectra and further validated with the organic reaction mechanisms.The impurities were identified as 9- (2
8、-oxo-4-butiric acid) -1, 4, 5, 7, 8, 9-hexahydro-purin-6-amine, hypoxanthine, inosine, 2-deoxyinosine, 9- (2-hydroxy-acetyl) -1, 9-dihydrogen-purin-6-amine, 3-deoxyinosine, 2, 3-anhydroinosine, 9- (2-ethoxy-4-methyl propionate-tetrahydrofuran) -1, 9-dihydrogen-6H-purin-6-amine.Conclusion:The LC-MS m
9、ethod is useful for the identification of related substances in pharmaceuticals.The related substances found in didanosine are valuable for its quality control.Keyword： anti-HIV therapeutic preparation; purine nucleoside drug; didanosine; identification of impurities; 9- (2-oxo-4-butiric acid) -1, 4
10、, 5, 7, 8, 9-hexahydro-purin-6-amine; hypoxanthine; inosine; 2-deoxyinosine; 9- (2hydroxy-acetyl) -1, 9-dihydrogen-purin-6-amine; 3-deoxyinosine; 2, 3-anhydroinosine; 9- (2-ethoxy-4-methyl propionate-tetrahydrofuran) -1, 9-dihydrogen-6H-purin-6-amine; LC-MS; Received： 2016 年 12 月 21 日去羟肌苷 (didanosin
11、e, 2, 3-双脱氧肌苷, 见图 1) 是一种嘌呤核苷类逆转录酶抑制剂, 竞争性地抑制逆转录病毒对自然底物三磷酸双脱氧腺苷作用, 中止 DNA 链的延长, 从而阻碍 HIV 病毒的复制增殖。临床上主要用于治疗齐多夫定 (AZT) 不耐受、无效或无症状 HIV 感染的艾滋病患者1-7。合成工艺以肌苷为起始原料, 经过溴化反应、消除反应、氢化反应得到去羟肌苷, 其有关物质的分析鉴定研究尚未见报道。图 1 去羟肌苷结构 Fig.1 Chemical structure of didanosine 下载原图本文采用液相-质谱联用技术对其有关物质进行进行鉴定研究, 并进行强制破坏试验。去羟肌苷在酸破坏
12、条件下不稳定, 主要破坏产物为次黄嘌呤, 在碱、光照及高温条件下较为稳定8-9, 对原料中 8 个主要有关物质进行了结构鉴定10-14, 其中 3 个有关物质并未见报道, 可为其质量控制提供参考依据。1 仪器与试药Shimadzu LC2010 液相色谱仪, LC Solution 工作站;Agilent 1 260 Infinity液相色谱-6224 飞行时间质谱仪, Mass Hunter 工作站;Thermo Finnigan TSQ Quantum Ultra AM 型 LC-MS/MS 联用仪;Xcalibur 工作站。Sartorius BS21S 电子天平。去羟肌苷对照品 (批号
13、:14703-200401, 含量 99.7%) , 次黄嘌呤 (杂质 A, 批号:140661-200903, 含量 99.5%) , 肌苷 (杂质 B, 批号:140669-201104, 含量 100%) 均购自中国食品药品检定研究院;2-去氧肌苷 (杂质 C, 批号:D239755, 含量 98%) , 3-去氧肌苷 (杂质 D, 批号:D239760, 含量 98%) , 2, 3-脱水肌苷 (杂质 E, 批号:A648370, 含量 97%) 均购自 Toronto Research Chemicals 公司;2, 3-二去氧-2, 3二去氢肌苷 (杂质 F, 批号:RGT8936
14、, 含量 99%) 购自深圳市瑞吉特生物科技有限公司;系统适用性试验对照品 (批号:69655-05-6, 含去羟肌苷 98.4%, 杂质 A 0.5%, 杂质 B 0.2%, 杂质 C 0.3%, 杂质 D 0.2%, 杂质 E 0.2%, 杂质 F 0.2%, USP 对照品) ;去羟肌苷原料 (批号:20121001、20121002、20121003) 由河南天方药业股份有限公司提供;甲醇和乙腈为色谱纯, 实验用水为超纯水。2 方法与结果2.1 色谱条件参照 Ch P2015 选择如下色谱条件12。Inert Surstain C 18 (250 mm4.6 mm, 5m;填料:十八烷
15、基硅烷键含硅胶) 色谱柱, 以 0.386%醋酸铵溶液加氨水调节p H 至 8.0 为流动相 A, 以乙腈-甲醇 (5050) 为流动相 B, 进行线性梯度洗脱 (A-B) 0 min (928) 15 min (928) 30 min (7030) 45 min (7030) 50 min (928) 60 min (928) , 检测波长 254 nm, 进样体积 20L, 柱温 25。2.2 质谱条件TOF/MS 质谱条件:Dual ESI 正离子扫描, 雾化气压力 350 k Pa, 温度 350, 干燥气流量 10 Lmin, 毛细管电压 4 k V, 碎片电压 100 V, 参比离
16、子 m/z 121.050 8 和 922.009 7, 质量数扫描范围 m/z 1001 200。MS/MS 质谱条件:喷雾电压 5 k V, 雾化气压 310k Pa, 辅助气压力 35 k Pa, 毛细管温度 350, 二级质谱扫描碰撞氩气压力 0.20 Pa, 碰撞能量 25 e V。2.3 系统适用性试验精密称取系统适用性试验对照品适量, 加稀释液 (流动相 A-B=9010) 溶解并定量稀释制成含去羟肌苷 0.5 mgm L 的溶液, 按2.1色谱条件, 精密量取20L 注入液相色谱仪, 记录色谱图, 见图 2-a。测得理论板数按去羟肌苷峰计算为 6 589, 杂质 C 峰与杂质 D 峰间的分离度为3.8。2.4 有关物质检查精密称取去羟肌苷原料 25 mg, 置 50 m L 量瓶中, 用稀释液溶解并稀释至刻度, 摇匀, 作为供试品溶液
