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1、鸡传染性支气管炎病毒广东分离株 S1基因的克隆与序列分析 卢秀娴 张思远 叶贺佳 梅廷媛 广州市华南农大生物药品有限公司 鸡传染性支气管炎 (infectious bronchitis, IB) 是由鸡传染性支气管炎病毒 (infectious bronchitis virus) 引起的一种急性、高度接触性传染病, 主要影响呼吸系统、消化系统、泌尿生殖系统等。各种日龄的鸡都会感染 IBV, 主要引起呼吸困难、肾炎、产蛋量和蛋品质的下降, IBV 还可侵害肾脏、肠道、腺胃、肌肉等组织, 给养禽业带来经济上的损失。IBV 自身有结构特殊性, 并且 RNA 聚合酶具有不完善的纠错机制能力, 使得病毒
2、基因组在复制的过程易突变和重组频率增高, 能够产生许多血清型, 目前已报道的血清型已有 30 多种, 在我国主要以 Mass, T, Gray 和 Holte 株等为主。IBV 基因组为线性单股正链 RNA, 全长约 27.6 kb, 编码小膜蛋白 (E) 、膜蛋白 (M) 、核衣壳蛋白 (N) 和纤突蛋白 (S) 4 种主要结构蛋白。当 S 蛋白与宿主细胞膜上的病毒受体结合, 并通过宿主细胞的蛋白酶裂解到 S1 和 S2 时, 病毒包膜可与细胞膜结合, 病毒纤突能表现出较强的特异性, S1 基因是诱导和选择性接受中和抗体的特异位点。S1 可刺激中和和血凝抑制抗体, 只有 S1 蛋白能诱导中和
3、抗体, 使机体起到有效地保护。虽然 IBV 的遗传变异可以在基因组中的任何部分发生, 但主要集中在病毒的 S1 基因。S1 蛋白是主要的感染性和致病性的病毒蛋白, 其结构差异性导致了血清型的差异及变异株的存在, 并且与 IBV 抗原性漂变和致病性的改变有关, 并且还可以决定 IBV 血清型特异性抗原决定簇。S1 蛋白的氨基酸序列之间的差异性有可能改变毒株之间的血清型, 导致新的变异株出现, 使其抗原性或免疫原性的改变。本研究于 2017 年 5 月份在广东省某疑似患鸡传染性支气管炎的鸡场病料被分离到 1 株 IBV, 并对 IBV 分离株 S1 基因进行克隆、测序和序列基因遗传变异分析。一、材
4、料与方法1. 病料来源、SPF 鸡胚及主要的试剂病料样品为 2017 年 5 月广东某鸡场疑似感染 IBV 鸡的气管、心脏、肝脏、肾脏等样品;10 日龄 SPF 鸡胚购自梅里亚实验动物中心;11 日龄 SPF 鸡胚购自梅里亚实验动物中心;RNA 提取试剂盒购自 Ta Ka Ra 公司、DL2000 DNA Marker 均购自北京全式金公司;2XPhanta PCR Master Mix 购自诺唯赞生物公司;反转录试剂盒和核酸染料均购自 TIANGEN 公司, p MD20-T 载体购自 Ta Ka Ra 公司2. 引物设计与合成根据 Genbank 中公布的 IBV S1 基因组序列, 利用
5、 Primer premier 6.0 软件及oligo6.0, 针对 IBV 基因组 S1 基因的保守基因区间设计 1 对特异性检测引物IBS1 (上游) :5-TTCAGGTGGCGTTGATAC-3 (下游) :5-AACCTTGGCCTACTCTGC-3;根据 S1 基因两端外的保守序列设计 1 对扩增 S1 全长基因的引物, 引物的理论跨幅为 1722bp, 可将 S1 基因片段完全覆盖, 引物序列:S1P1 (上游) :5-TTGAAAACTGAACAAAAGA-3, S1P2 (下游) :5-CCATAACTAACATAAGGGCA-3。由英潍捷基贸易有限公司合成引物。3. 病毒
6、分离采集临床病料 (主要是气管肝脏、肾脏等组织) , 研碎后加入适量 PBS, 在-20和常温条件下反复冻融 3 次, 8000 r/min 离心 10 min, 取上清液, 加入双抗 (含 200 U/ml 青霉素和 200g/ml 链霉素) 混合, 作用 2 h 后, 取 0.2 ml接种于 11 日龄 SPF 鸡胚的尿囊腔, 放于 37培养箱中孵育。3648 h 后收取鸡胚的尿囊液, 连续在 SPF 鸡胚上盲传 3 代。4. IBV 分离株 RT-PCR 鉴定和 S1 全长基因扩增提取病毒的尿囊液中的 RNA 基因组, 按照天根反转录试剂盒说明书进行反转录。以合成的 c DNA 为模板,
7、 采用 S1 基因特异性检测引物与 S1 基因全长引物分别进行 PCR 扩增, 反应条件为:95预变性 5 min;95变性 30 S, 54退火 30S, 72延伸 2 min, 35 个循环;72延伸 10 min。PCR 反应结束后取产物以 110V, 50 m A 电流进行电泳, 结果约 25 min 后在凝胶成像系统紫外灯下观察。5. IBV 分离株 S1 基因的克隆测序按照胶回收试剂盒说明书, 回收 PCR 扩增的 IBV S1 全长基因片段, 将回收的PCR 产物与 p MD20-T 克隆载体 4连接过夜, 转化大肠杆菌 DH5a 感受态细胞, 涂平板蓝白斑筛选, 挑去白色单菌落
8、接种到 LB 液体培养基中, 于 37恒温培养振荡器内震荡培养 12 h 后, 菌液经 PCR 鉴定后, 呈阳性的被选送至英潍捷基贸易有限公司测序部进行基因全长序列的测定及拼接。6. IBV 分离株 S1 基因的序列分析MEGA6.0 分析软件进行比较测定的 S1 基因序列, 与参考株绘制遗传进化树。其中序列比对使用 Clustal W 多重比对方法, 在进化树绘制中选用 Neighbor-Joining 算法。二、结果与分析1. 病毒的分离与鉴定将病料进行处理与分离培养, 利用针对 IBV 的 S1 基因特异性检测引物和 S1 全长基因的引物, 通过 RT-PCR 对鸡胚尿囊液进行扩增, 结
9、果能扩增出大小约为500 bp、1 722 bp 的两条预期目的片段, 而阴性对照没有扩增出条带 (图 1 和图 2) , 表明该毒株为 IBV, 命名为 CKGD/180/2017。2. S1 基因序列分析CK/GD/180/2017 S1 基因全长 1 620 bp (从起始密码子 ATG 到 S 前体蛋白裂解位点) , 编码 540 个氨基酸, 其裂解位点为 RRFRR, 与疫苗株 W93、D41 的裂解识别位点相同。和 50 株国内外代表及常用疫苗株的 S1 基因序列进行了比较, 同源相似性为 64.7%99.4%;与同一基因型的参考毒株 CK/CH/HN/HN99 等间相似性较高,
10、为 99.5%, 与目前我国常用疫苗 Mass 型的疫苗毒株相似性偏低, 与H120 和 H52 之间的相似性仅 80%82.2%。图 1 分离株 S1 基因 tex RT-PCR 鉴定电泳图 下载原图M-DL2000 DNA Marker、1.阳性对照 2.阴性对照 3.CK/GD/180/201图 2 分离株 S1 全长基因 RT-PCR 扩增电泳图 下载原图M-DL2000 DNA Marker、1.阳性对照 2.阴性对照 3.CK/GD/180/2017序列分析表明, 与其他参考毒株相比, 分离株 CK/GD/180/2017 的 S1 基因核苷酸序列存在大量的点突变, 还伴有碱基的插
11、入、缺失现象, 仅在少数区域相对保守, 主要集中在 1925、116120 位氨基酸处变异。IBV 中和抗体产生相关的抗原位点分别位于 S1 蛋白的第 2461、第 132149, 第 291398 处氨基酸。相关区域的抗原存在氨基酸突变、插入、缺失现象, 这可能导致病毒抗原性和血清型的改变, 并导致免疫失败。3 S1 基因系统发育进化关系分析将测定的分离株 CK/GD/180/2017 的核苷酸序列与参考毒株构建进化树 (结果见图 3) , 结果发现包括标准毒株在内, 所有毒株共分为 9 个基因型 (LX4 株、QXIBV 株等组成 I 群;英国分离株 4/91 与 UK/7/93 组成基因
12、 II 群;河南分离株CK/HN/HN99 等组成基因 III 群;广东分离株 CK/CH/GD/ZJ10/2013、HN08 株组成基因群、台湾分离株 TW2575/98 和 TW2296/95 等组成 V 群;CK/CH/GX/NN11-4株等组成基因群;JASS 株等组成的基因群, 肾型分离株 ARK99 株、Holte 株等组成 Gray 型, 疫苗株 H120 等代表的 Mass 型) , 其中 CKGD/180/2017 属于基因群, 与 H120 代表的 Mass 型疫苗株的亲缘关系较远。图 3 IBV S1 基因系统进化树 下载原图注:“”代表分离毒株三、讨论在本研究中, 同一
13、分支的参考毒株与 CK/GD/180/2017 属于基因型群, 其核苷酸序列和推导的氨基酸序列具有高度同源性, 分别在 91.9%99.4%和93.9%99.4%之间, 裂解位点 RRFRR, 是否发生重组, 是否因为基因的突变缺失插入现象, 导致其毒力和致病性增强和组织嗜性发生改变, 仍需进一步验证。病毒中和抗体和血凝抑制抗体都是 S1 基因诱导产生, 并介导病毒与宿主细胞结合, 所以常用 S1 基因的遗传进化关系、序列分析来研究 IBV 的流行趋势。目前广东省内普遍使用的主要是 Mass 型 H120 和 H52 疫苗, 但由于 IBV 基因组传播过程中会导致多种基因型及血清型毒株的产生, 如果地方流行毒株和疫苗毒株的血清型不一致, 仅用单一或两个血清型的疫苗, 就不能有效的保护, 不同血清型之间仅有部分或完全没有交叉免疫保护, 发病的情况仍然出现。因此此分离鉴定地方流行的血清型毒株, 对其特性的研究来进行本地的防控。
