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1、HPLC-DAD 测定 5 种苯类化合物（实验报告）环境工程 刘鹏 123351一、实验目的1掌握高效液相色谱分析法中的基本原理（包括分配分离原理、二极管阵列检测器检测原理） 。2基本了解高效液相色谱（1200LC）组成结构，硬件操作及掌握化学工作站的开机，关机，参数设定，数据采集及分析的基本操作。3了解二极管阵列检测器的基本原理和特点，基本掌握从三维图谱中找出化合物的最大吸收波长。4掌握高效液相色谱定性、外标定量方法。二、实验原理分配色谱原理：主要基于样品分子在流动相和固定相间的溶解度不同（分配作用）而实现分离的液相色谱分离模式。C18 柱 -反相 HPLC（reversed phase H
2、PLC）：由非极性固定相和极性流动相所组成的液相色谱体系。其代表性的固定相是十八烷基键合硅胶，代表性的流动相是甲醇和乙腈。是当今液相色谱的最主要分离模式，几乎可用于所有能溶于极性或弱极性溶剂中的有机物质的分离。二极管阵列检测器（diode-array detector, DAD）工作原理：以光电二极管阵列（或 CCD 阵列，硅靶摄像管等）作为检测元件的 UV-VIS 检测器，它可构成多通道并行工作，同时检测由光栅分光，再入射到阵列式接受器上的全部波长的信号，然后，对二极管阵列快速扫描采集数据，得到的是时间、光强度和波长的三维谱图。与普通 UV-VIS 检测器不同的是，普通 UV-VIS 检测器
3、是先用单色器分光，只让特定波长的光进入流动池。而二极管阵列 UV-VIS 检测器是先让所有波长的光都通过流动池，然后通过一系列分光技术，使所有波长的光在接受器上被检测。 （Agilent 1200 DAD 全扫描波长范围为190nm-950nm）Agilent 1200 LC 液相色谱仪的工作过程：输液泵将流动相以稳定的流速（或压力）输送至分析体系，在进入色谱柱之前通过自动进样器将样品导入，流动相将样品带入色谱柱，在色谱柱中各组分因在固定相中的分配系数不同而被分离，并依次随流动相流至检测器，检测到的信号送至数据系统记录、处理或保存。外标法定量：外标法是色谱分析中一种简便的定量方法。当样品中所有
4、组分都得到良好的分离并都能被检测而得到色谱峰时，则可利用外标法定量计算样品中各组分的浓度。其定量的依据是被测物质的量与它在色谱图上的峰面积（或峰高）成正比。数据处理软件（工作站）可以给出包括峰高和峰面积在内的多种色谱数据。一般由被测物所配标准浓度与峰面积做标准曲线，由标准曲线求出被测物浓度。三、仪器及试剂1、仪器：Agilent 1200 HPLC（四元泵、自动进样器、柱温箱、 DAD检测器、C18 色谱柱) ，稳压电源。2、试剂： 色谱级乙腈、甲醇；Miniport超纯水；含5个苯类化合物的标准品；实际测试水样四、实验方法1.进样器洗针进样 进样量 20.0L2.设置泵流速 1.5ml/l
5、溶剂停留时间 7.0min H2O 20%后运行时间 2.0min 甲醇 80%时间表时间 %C0.0 801.0 801.01 100.07.00 100.03.柱温箱温控温度 35C4DAD 信号254 4 360 100 所需灯280 16 360 100 紫外灯光谱储存全部范围：190-400nm五、实验步骤5.1 上机准备根据待测物要求配制 5 个浓度点标准样品，待测水样 1-2 个（样品需要前处理） ，查阅文献，获得目标分析物质或相近物质的液相色谱分离条件。检查线路是否连接完好。检查流动相、洗针液是否充足，不足则根据要求添加。有机流动相必须为进口 HPLC 级，水相可使用 Mill
6、ipore 纯水机出水或娃哈哈屈臣氏纯净水。所有流动相在使用前均需用 0.2m 的滤膜过滤（水和缓冲液用水相滤膜,有机相用有机相滤膜） ，其中水相需每天更换以保持新鲜。标样和样品在使用前必须用 0.2m 的针头式滤器（进口非分装）过滤。将样品放置在样品托盘上，并记录相应的位置。且第一个和最后一个样品为不含营养盐的流动相，用于清洗进样系统及管路。（其中有下划线部分为实验课程中未涉及部分）5.2 开机1打开稳压电源（指针指示 220V） ，打开仪器面板 Accela AS、Accela PDA、Accela Pump电源开关。2打开电脑，双击工作软件 Xcalibur，在 status 状态栏下看
7、到 AS、PDA 、Pump 三项显示ready to download；仪器面板灯除 Pump 部分的 RUN 灯呈橙色外，其余灯均为绿色，表明仪器及通讯正常，可进行下一步操作。3 purge 管路系统，直至无气泡。方法如下：打开 Accela Pump 左侧的门，将塑料针筒接到purge 阀的输出管上，逆时针拧松 purge 阀；将 Accela pump 中的 purge 阀拧到左边；点击软件双击Roadmap 中 Instrument Setup 图标，显示 Instrument Setup 界面，点击左侧仪器图标中的 Accela Pump，点击下拉主菜单中 Accela Pump
8、栏中的 direct control 跳出该界面；在“take pump under control”栏打勾，输入 flow 为 600l/min，选择相应的流动相（设为 100%） ，点击 play 键开始purge， 10min 左右可按停止键；同样的方法可 purge 其它流动相通道，直至管路中没有气泡。Purge 完后将 purge 阀顺时针拧到右边，取下针筒中的废液倒入指定的废液桶。4检查 Accela AS 门上自动进样针筒上部黄色密封圈上端是否有气泡，如有气泡则要先行排气，方法如下：点击软件双击 Roadmap 中 Instrument Setup 图标，显示 Instrumen
9、t Setup 界面，点击左侧仪器图标中的 Accela As，点击下拉主菜单中 Accela As 栏中的 direct control 跳出该界面；选择 Flush syringe，点击 apply（注意此时要关上 AS 的门） ；连续数次赶尽气泡。5 稳定泵系统。双击软件 Roadmap 中 Instrument Setup 图标，显示 Instrument Setup 界面，点击左侧仪器图标中的 Accela Pump，点击下拉主菜单中 Accela Pump 栏中的 direct control 跳出该界面；在“take pump under control”栏打勾，输入所需流动相启
10、动泵系统，运行 20min 后方可进行其它操作（如运行 sequence） 。5.3建立method打开 UPLC 工作站 Xcalibur，双击 Roadmap 界面中的 Instrument Setup 图标，点击 Accela AS、Accela PDA、Accela Pump 图标分别设置参数。Accela AS 参数设置：除 Injection volume（可设为 1-20l ）外，其余参数请不要更改。Accela PDA 参数设置：根据样品实际情况对 run lengthtime、spectra、channels 等进行设置。Accela Pump 参数设置：选择 Gradien
11、t Program 界面，编辑流动相梯度（注意正确选择通道，以免气泡进入系统）参数设置完后保存方法（默认路径为：d:UPLCmethod） 。5.4 建立sequence点击 sequence view 图标进入 sequence 编辑界面。对于已建分析方法的样品，可直接在原来的sequence 内添加样品信息。新建 sequence，样品类型选择 Unknown，双击 InstMeth 和ProcMethod（如没有工作曲线时可先不填此项）输入方法名及定量分析方法，输入分析样品在 Accela As 中的位置以及进样量，以此类推编辑整个序列，遍及完后保存序列，并点击按钮运行。5.5 样品分析
12、点击按钮 real time plot play 可以看到实时采集的数据。开启仪器半小时左右，可观察到仪器信号基线平稳。sequence 设置完毕后，点击 run sequence 进行样品分析（注意选择所需分析样品的序列号） 。在做标样时，标样也先作为未知样品分析，待所有样品分析完后再进行定量分析。5.6 分析结束进样系统清洗：以不含营养盐的流动相为样品（最后一个样品）run2-3 次，清洗进样系统。管路及柱系统清洗（重要）：用一定比例的有机相和纯水（不含缓冲盐以及甲酸、乙酸、醋酸铵等其它添加物）流动相洗柱, 至无明显出峰为止。最后用 80%以上的有机溶剂保存柱子。关闭工作站窗口，退出工作站
13、；关闭仪器面板 Accela AS、Accela PDA、Accela Pump 电源开关；关闭电脑，关闭稳压电源。取出样品瓶，清洁桌面，在仪器使用记录本上登记。5.7 数据处理定量分析过程（建立工作曲线）参考“Xcalibur 定量分析”说明书。未知样品结果分析，打开 sequence 在 Pro Meth 中输入定量分析方法。选择需计算浓度的样品，点击 Batch Reprocess Setup，选择 Quan 栏，Peakdetection&Intergration 以及 Quantitation（注意其余选项不要打勾） ，点击 OK。点击 Roadmap 进入 Quan Browser
14、，打开 sequence 文件名，选择显示所有数据，点击 unknows 查看样品结果。六、数据处理1）原始数据实验所得色谱图min0 1 2 3 4mAU 05101520253035 VWD1 A, 波=254 nm (D:SKLDAT201204DEF_LC 2012-04 1-05-104-01.D)1.20 1.492.192.50 2.810 3.67标准样品数据浓度（ppm）邻苯二甲酸二甲酯 邻苯二甲酸二乙酯 联苯 邻-三联苯 2-乙基，己基-邻苯二甲酸酯2 19.001 35.831 12.858 18.941 13.9644 34.873 46.582 25.618 37.7
15、13 27.6566 48.614 55.392 35.367 53.904 39.2248 67.406 65.735 48.677 73.339 54.6810 78.425 82.241 59.042 89.482 66.836（2）数据处理根据标准样品的实验数据，做出峰面积随浓度变化的标准曲线。邻 苯 二 甲 酸 二 甲 酯y = 7.569x + 4.2495R2 = 0.99550204060801000 2 4 6 8 10 12浓 度峰面积邻 苯 二 甲 酸 二 乙 酯y = 5.5987x + 23.564R2 = 0.98530204060801000 2 4 6 8 10
16、 12浓 度峰面积联 苯y = 5.7714x + 1.6843R2 = 0.99810102030405060700 2 4 6 8 10 12浓 度峰面积邻 -三 联 苯y = 8.8354x + 1.6634R2 = 0.99920204060801000 2 4 6 8 10 12浓 度峰面积2-乙 基 ， 己 基 -邻 苯 二 甲 酸 酯y = 6.6384x + 0.6416R2 = 0.9985010203040506070800 2 4 6 8 10 12浓 度峰面积根据标准曲线，计算实际单标中的物质浓度物质种类邻苯二甲酸二甲酯 邻苯二甲酸二乙酯 联苯 邻-三联苯 2-乙基，己基-邻苯二甲酸酯
