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1、 1、真菌的污染 真菌(fungi) 一类没有叶绿素，异养的真核微生物。除极少数种类是单细胞外，绝大多数是由多细胞组成的菌丝，结成一团的菌丝称菌丝体，菌丝分有隔菌丝和无隔菌丝两种。有隔菌丝是由多个细胞组成，相邻的细胞之间由隔丝隔开。在地球上广泛存在于空氣、水、土壤以及各類生物的體表或體內。皆可有真菌生长。大气中已知的真菌有 11255 属 10 万种，在室内常附着在物体表面，能自动或随人的活动而扩散。种类丰富，分布广泛，繁殖快速，无处没有，无处不在。一个季节繁殖 4-5 代，孢子可达1 万亿个 室内真菌种类：主要有芽枝孢霉属、曲霉属、铰链孢霉属、镰刀霉属、青霉属等，真菌数量的多少，与温度、湿度
2、有很大关系。真菌以腐生、寄生或共生的型式進行異營性生活。釋放消化酵素於鄰近的環境，以分解食物成較小的水溶性分子進入細胞內消化。並可於菌絲產生孢子以完成有性或無性繁殖。 真菌季节变化：春、夏季尤其是南方的梅雨时节温暖潮湿，非常适合真菌生长。冬季室内真菌浓度较高。 空调加重污染：如果长期使用空调而不注意通风，可引起室内真菌污染。室内有空调比没有空调情况下曲雾菌落数多 4 倍。2、细菌（bacteria）的污染 细菌是一类微小的单细胞生物，约有多种。从形态上看，细菌可以分成球菌、杆菌和螺旋菌类。细菌是无孔不入的微生物，儿童玩具、手机、计算机键盘和衣服上，甚至植入人体的医用植入物等（如心脏起搏器），都
3、随时有可能沾染细菌，对人体造成危害。为避免细菌的侵袭，科学家曾尝试用抗微生物材料生产各种用品，但效果不十分理想，因为这些材料虽然能杀死细菌，却充满化学物质。细菌是处于生物和无生物之间的东西。泥土里、水里、都市的空气里都有细菌散布着，多到 50 种以上。 三类细菌的形状：就是球形的，杆形的，及螺旋的。球形的有的正圆，有的卵圆；杆形的有长有短，有的微弯螺旋形的也有长短和弯曲的转数多少的不同，有的生着细毛，毛长与短多少不定。虽然概括地说，形状只有球形、杆形、螺旋形这几种，但细分起来，形状还是很不少。论大小，它长约 12 微米，阔 0.5 微米余。病菌，能分泌出毒质，如果寄生在体里，因病菌种类的不同，
4、人就会发生不同的疾病。3、组织培养过程中的污染源 1。户外风大菌类进屋机会多 2。屋内太潮菌类繁衍多 3。物品带菌多 4。屋内不干净 5。屋内清理带菌组培苗 6。接种不正确4、菌类传播途径 1户外风传播 细小如尘 随风飘散 由上下落 见湿就长 有风就有沙 有沙就有尘 有尘就有菌 菌尘混共存 2涡流传播 我们在大街上常常看到一些大货车驶过后，马路上的尘土、纸屑打着转满天飞，这就是汽车行驶搅动空气形成的涡流。汽车的前挡风玻璃、车顶、车侧、车后都可以产生涡流。涡流在自然界可说是无所不在，在这些涡流中人们若是想要观察涡流旋转方向改变的话就必须将整个涡流给破坏掉。超净工作台上，摆放物品太多，当无菌风吹过
5、时，就会在物品周围形成涡流群，菌类就会在涡流群中停留，从而降低净化效果，增加污染机会。 3接种传播脏手每只带有细菌 4 万40 万，干净的手，指甲盖大小也有 3200 多个细菌。指甲缝可以窝藏 30 多种细菌。1 克重的指甲垢里竟藏有 38亿个细菌。洗的手 3 小时后，在大拇指的细菌由原来的 300 个变成 30 万个。如果手上带菌较多，在操作过程中，就难免有菌落入培养基或植物材料上，而导致污染。用肥皂洗手比不用肥皂洗手的杀菌功效要大810 倍。流动的温水可去掉 95%以上。因此，在注意个人卫生的同时，操作前一定要对手进行彻底消毒。 另外，不正确操作也会增加污染机率掀盖生硬，灭菌不够，操作过慢
6、等。接种过程应该轻开盖，火灭慢，操作快。5、相应的措施通风：经常开窗，保持室内空气流通可以使室内真菌数量减少。通风方法简便易行应多使用。去湿：保持室内空气干燥，如使用空调“除湿”功能，也可减少真菌生长繁殖。光照：紫外线能杀灭或抑制真菌生长，有调查发现下午一时是大气细菌粒子沉降的一个低谷，说明太阳辐射对空气微生物有明显的杀灭作用。因此，保持室内较好采光，在梅雨季节后将衣物等晾晒，对减少室内真菌污染大有好处。防霉：污染物品和污染培养基不要在培养室近距离开瓶洗刷。 6、污染原因判断及污染苗抢救 1若污染菌类是零星分散在培养基中，则可确定是人为引起的污染，比如培养基灭菌不彻底；超净工作台长时间不换滤网
7、，致使净化能力降低；接种用具灭菌不彻底；操作不正确，动作生硬缓慢，开瓶时间太久，接种台摆放物品杂乱，操作中心在人体范围之内；接种室长期不灭菌，菌类太多。 若污染菌类是从材料周围长起，则可证明是植物材料带菌引起。可能是接种用具灭菌不彻底，接种时材料被污染；或者是未及时发现污染苗，接种过程交叉感染； 若是外植体，菌类从材料培养基以上部分长起，而不是从培养基先长起，且发生在 5 天以后，则说明是材料带的内生菌。若从培养基以下开始长菌，发生时间较早，且有从里向外的趋势，则说明是切口引起的污染，原因有是灭完菌后，未剪去两个切口或虽剪但器具带菌； 2真菌污染后，如果已形成孢子，则必须经高压灭菌后扔掉，即使
8、仅形成菌丝，菌丝能够达到材料内部，因此，真菌污染是灭绝性的。但若使细菌污染，由于细菌繁殖是靠芽孢，细菌不会弥散整个空间，因此只要及时发现，将材料上部未感菌的部分剪下转接，材料仍可以用。 3用抗生素等杀菌药剂的处理，虽有不少报道，但至今还未发现那种抗生素能够对各种菌都有效，并且常常也会影响植物材料的正常生长分化。另一些药剂，虽有的杀菌效果好，但往往容易引起盐害，也无法利用。 4本研究室自 1999 以来，在污染防治研究和简化组培的基础上有了突破性进展，通过对国内外近百种抑菌材料的选择、配比，成功研制出了广谱性杀菌药剂山农 1 号。该药剂在低浓度下，就能抑制各类真菌和细菌的生长繁殖，在不经高压灭菌
9、和超净工作台接种的情况下，在 40 天内，污染率也能控制在 5%以下，在 2003-2004 年，本试验室进行了大规模的污染防治和开放接种试验，试验表明，利用山农1 号进行彻底简化组培环节，降低组培生产，使组织培养走出试验室，进入千家万户，是完全可能的。本研究有望在 2005 年，进行鉴定和推广应用。植物组织培养是 20 世纪初发展起来的一门新兴技术，随着这项技术的日益完善，其应用也越来越广泛，可用于种苗快繁、植物脱毒、植物育种、种质资源保存以及次生代谢物提取等方面。尤其植物快繁和脱毒是应用最多和最广的方面，而且许多花卉苗木的试管育苗已进入了商品化生产。但是在组织培养过程中，常常会出现一些困难
10、使试验无法进行下去，甚至导致整个试验失败，给科研和工厂化生产带来损失。污染是组织培养中经常遇到的困难。污染是指在植物组织培养过程中，培养基和培养材料滋生杂菌，最终导致培养失败的现象。现将在矮牵牛、菊花、树莓等组织培养研究中的一些体会，从污染的原因、影响因素和防止措施几方面进行浅析，为科研和工厂化生产提供一定的参考价值。l 污染的原因在培养过程中污染是经常发生的。它会导致培养基和培养材料上滋生杂菌，最终组培失败。在科研和商品化生产种苗中，污染率是与经济效益紧密相关的一个重要指标，控制污染率无疑是一项提高经济效益、节约材料的有效途径之一。因此，探讨和重视污染在科研和生产中显得十分重要。11 造成污
11、染的病原菌在矮牵牛、菊花、树莓等的组培过程中，发现了不同程度的污染现象，其污染物主要是真菌(木霉、青霉、曲霉、毛霉)和细菌。12 污染的症状及原因真菌性污染主要指霉菌引起的污染。一般接种后 38 d 可在培养基中发现各种颜色的菌斑。真菌性污染，一股多由接种室内的空气不洁净、超净工作台的过滤效果不理想、操作不慎等原因引起。细菌性污染的主要症状是材料附近出现黏液状和发酵泡沫状物体，或在材料附近的培养基中出现混浊和云雾状痕迹。一般在接种后 12 d 即可发现。细菌性污染除外植体带菌或培养基灭菌不彻底外，主要是操作人员的不慎造成。除要求操作人员严格按照无菌操作程序操作外，外植体带菌引起的污染与外植体的
12、种类、取材季节、部位、预处理方法及消毒方法等密切相关。2 影响污染的因素21 外植体本身植物组织培养的成败除与培养基的组分有关外，另一个重要因素就是外植体本身，即由活体植物上切取下来，用以进行离体培养的那部分组织或器官。为了使外植体适于在离体条件下生长，使组织培养工作顺利进行，有必要对外植体进行选择与处理。首先，应该从田间或温室中生长健壮的无病虫害的植株上选取发育正常的器官或组织作为外植体，离体培养易于成功。对于大多数植物来说，茎尖是较好的外植体，由于茎形态已基本建成，生长速度快，遗传性稳定，病毒含量低或无病毒，所以是获取无病毒苗的良好途径。但是，不同植物的不同部位，由于其本身的生长特点，在外
13、植体培养中也存在着各种差异性。比如，各部位的分化再生能力不同，各部位接种后的污染率也不同，各部位培养形成的再生植株的脱毒率也不同。所以选取外植体时应选择适当大小的、病毒含量低的、易于消毒和灭菌的外植体，这样才能保证在组织培养中污染率低、脱毒率高、成活率高。如在芳香植物唇萼薄荷的组织培养中，由于其组织非常柔嫩且表面密生绒毛，在自然条件下，表面常被霉菌和细菌污染。所以在培养时，选取去掉叶片的带腋芽的幼嫩茎段进行繁殖，这样既能降低污染率(因为去除了污染率较高的叶片)，又能提高成活率。还如在广佛手的组织培养中，不同外植体的顶芽的污染率最低，成活率最高，叶片次之，带节茎的污染率最高。另外，不同季节取材的
14、外植体，污染率也不同。如在广佛手的培养中，春季取材与秋季取材差别不大，夏季污染率就高，明显高于冬季。因此，适当的时候取材会降低污染率。所以，为了降低污染率、提高成活率选取外植体应该从多方面考虑。2.2 培养条件在培养室内的培养条件中，温度和湿度与污染率密切相关。外植体在夏季培养时，由于夏天高温高湿有利于杂菌滋长，所以污染率就高；冬季培养时，污染率就相对低一些。如在广佛手、矮牵牛、菊花、树莓的组织培养中，外植体在夏季污染率和死亡率就高；在冬季就相对低一些。此外，一些用于组织培养的植物，在自然条件下的生长环境也会影响污染率。有报道指出，生长在高温多雨的热带、亚热带植物和多年生木本植物容易出现内生细
15、菌的污染。内生细菌存在于植物材料内部，不能被一般的表面消毒方法所清除，随着材料带人培养过程引起污染。3 防止措施组织培养中降低污染率是不可忽视的技术环节。以下是在矮牵牛、菊花、树莓等的组织培养中总结出来的几点污染防止措施。31 外植体的采集为了防止材料带菌，我们在采集外植体时，应注意以下几点：在生长健壮的无病虫害的植株上选取发育正常的组织或器官；或将嫩梢采集回来，放在洁净的空气中水培抽芽，然后用这种新生组织培养，也可以避免污染。在晴天中午采集外植体。采集易于消毒和灭菌的组织部位进行培养，也可以降低污染率。32 材料的表面消毒外植体在接种之前，须经严格的灭菌。由于灭菌剂的种类不同，杀菌力不同，因
16、此选择消毒剂，既要考虑具有良好的消毒、杀菌作用，同时又易被蒸馏水冲洗掉或能自行分解的物质，而且不会损伤或轻微损伤组织材料，而不影响生长。植物种类不同，外植体不同，处理也不同。为了获取无菌材料，对室外采集来的外植体，先用自来水冲洗干净，然后根据材料的不同，选用不同种类的灭菌剂，进行不同时间的表面灭菌。选择适宜的消毒剂处理时，为了使其消毒效果更为彻底，有时还需与黏着剂或润湿剂如吐温及抽气减压方法、磁力搅拌、超生振动等方法配合使用，使消毒剂能更好地渗入外植体内部，达到理想的消毒效果。如在芳香植物唇萼薄荷组织培养中，由于腋芽密生绒毛且部位通常较隐蔽，似很难与消毒液彻底接触，致使消毒效果不理想，于是在饱和漂白粉溶液中加入01Tween80 混合均匀，并采用软毛刷轻轻刷洗材料，尤其是腋芽部位，这样可以使消毒液与材料充分接触，使消毒效果明显提高。此外，如果在继代培养中发现污染，我们可以采用抗生素(如青霉素、氮苄青霉素等)和杀菌剂(如多菌灵、代森锌等)处理
