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1、生化实验总结报告实验名称：SDS - PAGE 法测定蛋白质的相对分子量 作者： 田景辉（201306230114） 专业： 生物工程 指导教师： 许培雅 日期： 2015.12.30 组员：杨瑞 徐巧妹 尹彪 程健 刘嘉南目 录一、实验介绍3二、实验原理3三、实验材料、试剂、器皿4四、操作步骤5五、注意事项7 六、实验数据记录与处理 7七、总结与建议 8八、术语表9九、参考文献 9十、附录9一、实验介绍1.实验目的掌握 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法和测定蛋白质分子量的技术。2.实验背景在实验一中，用 100g 新鲜酵母用甲苯自溶法、研磨法、SDS（十二烷基苯磺酸钠）法进行了蔗糖酶的提取以及粗
2、提取，得到初提取液 A、热提取液 B、乙醇提取液 C。最终得到 9.0ml 蔗糖酶初提取液。实验二采用 QAE-葡聚糖凝胶离子交换柱层析法进行蔗糖酶的纯化，得到经线性阶梯洗脱的分离液 D1 和经阶梯梯度洗脱的分离液 D2。实验三采用苯基琼脂糖凝胶柱层析法进行进一步纯化，得到经 2mol/L (NH4)2SO4的 0.05mol/L Tris-HCl ph7.3 缓冲液洗脱的分离液 E1 和经 2mol/L NaCl 的 0.05mol/L Tris-HCl ph7.3 缓冲液洗脱的分离液 E2。二、实验原理SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进 SDS（十二烷基硫酸钠）， S
3、DS 会与变性的多肽，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合 SDS 的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此 SDS 多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关，在达到饱和的状态下，每克多肽可与 1.4g 去污剂结合。当分子量在 15KD 到 200KD 之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW 为分子量，X 为迁移率，k、b 均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。生物化学上指在进行 SDS-PAGE（S
4、DS-聚丙烯酰胺凝胶电泳）中由于凝胶孔径的不连续性（2 种孔径）、缓冲液离子成分的不连续性(2 种缓冲体系)、PH值（3 种 PH）和电位梯度的不连续性使得蛋白质分子在浓缩胶和分离胶的界面处浓缩成一条狭小的缝带，成为浓缩效应。三、实验材料、试剂、器皿(1).试剂材料：1、30%丙烯酰胺贮液：丙烯酰胺（Acr 作为单体） 29.2g，甲叉双丙烯酰胺 (Bis作为交联剂）0.8g ，溶解于双蒸水 100ml，中枢神经毒物凝聚后无毒。2、10%的 N，N，N ，N-四甲基乙二胺(TEMED)：0.1mlTEMED+0.9ml 双蒸水（凝固加速剂）；3、10过硫酸铵溶液（凝固的催化剂）； 4、分离胶缓
5、冲液贮液（1.5molL Tris-HCl，pH8.8）；5、浓缩胶缓冲液贮液（1molL Tris-HCl，PH6.8）；6、2 SDS-样品缓冲液：1ml 浓缩胶缓冲液贮液 + 4ml 10%SDS + 1ml 疏基乙醇 + 2ml 甘油 + 0.5ml 0.1%（ w/v）溴酚蓝（电泳指示剂），加双蒸水至 10ml。4保存；7、SDS-电极缓冲液贮存液（0.025mol/L Tris，0.25mol/L 甘氨酸，0.1SDS，pH8.3）：在 900ml 双蒸水中溶解 15.1g Tris 和 94g 甘氨酸，加入50ml 10%（w/v ）SDS 贮液，加双蒸水补至 1000ml 则成
6、 5SDS-电极缓冲液；8、10% SDS：25g SDS 用双蒸水溶解至 250ml，室温保存； 9、染色液：0.25gR250 考马斯亮蓝溶于 90ml 甲醇水（11，v/v）和 10ml 冰乙酸的混合液10、脱色液：50ml 甲醇加 75ml 冰乙酸，加蒸馏水至 1000ml；11、蛋白质样品液12、标准蛋白质：包括兔磷酸化酶 B，MW97400 ；牛血清蛋白，MW66200；兔肌动蛋白， MW43000；牛碳酸酐酶，MrW31000；胰蛋白酶抑制剂，MW20100；鸡蛋清溶菌酶， MW14400。蛋白质样品液：1.初提液 A 2.乙醇提取液 C 3.离子层析柱分离液 D1(QAE-葡聚
7、糖凝胶离子交换剂) 4.离子层析柱分离液 D2(DEAE-葡聚糖凝胶离子交换剂 ) 5.疏水层析柱分离液 E1(phenyl bestarose 6 Fast Flow) 6.疏水层析柱分离液 E2(Octyl Sepharose 4 Fast Flow) (2).仪器：容量瓶、移液管、试管及试管架、移液枪、玻璃板、胶架、电泳槽等四、操作步骤1. 制胶1.1 组装胶架 将洁净、无水的玻片对齐，形成空腔，插入塑料框的凹槽中，注意箭头向上，并确保下端平齐。放于制胶架上夹紧，下端紧贴密封条。1.2 分离胶的配置 1.2.1 12%分离胶配方如下表：12%胶 蒸馏水 30丙烯酰胺贮存液分离胶缓冲液 P
8、H 8.810%SDS 10%AP(过硫酸铵)TEMED10ml 3.3 ml 4.0 ml 2.50 ml 0.10 ml 0.1 ml 0.04ml1.2.2 灌胶 混匀后用移液枪将凝胶溶液沿玻棒小心注入到长、短玻璃板间的狭缝内(胶高度距样品模板梳齿下缘约 1cm)。 12.3 液封 在凝胶表面沿短玻板边缘轻轻加一层水以隔绝空气，使胶面平整。静置约30min 观察胶面变化，当看到水与凝固的胶面有折射率不同的界限时，表明胶已完全凝固，倒掉上层水，并用滤纸吸干残留的水液。1.3 浓缩胶的配置 1.3.1 5%浓缩胶配方下表：4%胶 蒸馏水30丙烯酰胺贮存液 分离胶缓冲液 PH 6.810%SD
9、S 10%AP(过硫酸铵)TEMED4 ml 2.7 ml0.67 ml 0.5ml 0.04 ml 0.04 ml0.04 ml1.3.2 插入制胶梳 混匀后用移液枪将凝胶溶液注入到长、短玻璃板间的狭缝内(分离胶上方)，轻轻加入样品模板梳，小心避免气泡的出现。约 30 分钟，聚合完全。2. 加样品将样品和标准蛋白质溶液分别与 2SDS-样品缓冲液等体积混合，100水浴加热 3-5 分钟。将制好的凝胶平板装进垂直平板电泳槽。下槽放进 SDS-电极缓冲液，凝胶底部要保证没有气泡。将与 SDS-样品缓冲液混合后的样品液和标准蛋白质各 20l 加入到样品槽中，小心地与 SDS-电极缓冲液充满样品槽，
10、然后在上槽加入 SDS-电极缓冲液。3. 电泳3.1 安装电泳槽 将制备好的凝胶板取下，小心拔下梳子。两块 10%的凝胶板分别插到 U 形橡胶框的两边凹形槽中，可往上提起使凝胶板紧贴橡胶。将装好玻璃板的胶模框平放在仰放的贮槽框上，其下缘与贮槽框下缘对齐，放入电泳槽内。3.2 电泳在电极槽中倒入 pH8.3Tris-HCl 电极缓冲液，内含 0.1%SDS 即可进行电泳。在制备浓缩胶后，不能进行预电泳，因为会破坏 pH 环境，如需要电泳只能在分离胶聚合后，并用分离胶缓冲液进行。预电泳后将分离胶面冲洗干净，然后才能制备浓缩胶。开始电流为 10mA 左右，待样品进入分离胶后，改为 20-30mA，当
11、染料前沿距离凝胶底部边缘 1,。5cm 时，停止电泳关闭电源。4. 染色和脱色电泳结束后，取出凝胶平板，移去玻璃板，将凝胶浸泡于染色液中，染色 4h，然后进行脱色液脱色，数小时换一次脱色液，直至背景无色。为加速脱色可将脱色液加热。5. 样品相对分子质量确定以标准蛋白质相对分子质量的对数 lgMW为纵坐标，相对迁移距离为横坐标作图，得到标准曲线。然后根据样品蛋白质的相对迁移距离，从标准曲线所得方程求出其相对分子质量。相对迁移距离=蛋白质分子迁移距离/染料迁移距离五、注意事项1、根据目的蛋白的大小选择合适的胶片浓度。一般为 100KD-50KD 选用 10%胶；50KD-30KD 选用 12%胶；
12、30KD-10KD 选用 15%胶。2、要根据样品浓度来加样品溶解液。每加一个样品后换一支吸头或清洗吸头后再点另一个样品。3、制备聚丙烯酰胺凝胶时，倒胶后常漏出胶液，那是因为二块玻璃板与塑料条之间没封紧，留有空隙，所以这步要特别留心操作。4、电泳完毕撬板取凝胶时要小心细致不能把胶弄破。5、电泳缓冲液可重复利用，如果胶上出现不正常痕迹，就要及时更换新液。6、分离胶高度控制得当，确保有大约 1cm 左右的浓缩胶空间。过长或过短均不能得到理想的电泳结果。7、电泳染色液注意进行回收再利用，一般可重复使用 2-3 次。8、AP 和 TEMED 是催化剂，加入的量要合适，过少则凝胶聚合很慢甚至不聚合，过多
13、则聚合过快，影响倒胶。六、实验数据记录和处理由于制备凝胶的时候存在浓度误差，导致标准蛋白质样品其中两条没有分离出来，可能是由于分子质量过大，没有跑下来。第一组：提取液 A 中有一条带明显，标准蛋白有五条带较明显，其他的不明显，无法识别。第二组：和第一组情况相同，标准蛋白质样品只有 5 条带明显，A、B 中明显的带后来消失不见，说明那是杂蛋白，且浓度较大；C、D、E 中的带很模糊，可能是因为层析后致使酶浓度过低。七、总结与建议本次实验是整个实验的最后一项实验，也是对之前实验的一次总结。实验相对简单，结果处理也比较简单，但由于我们小组在制胶时存在较大误差，导致实验结果并不理想，但是后续的结果处理还
14、是能测定出我们组的蔗糖酶的分子量大小。通过本次实验，我们掌握了凝胶电泳的作用原理以及操作方法。八、术语表1.凝胶：凝胶是指颗粒大小在 1 埃到 10 埃之间的混合物。高分子溶液和某些溶胶，在适当的条件下，整个体系会转变成一种弹性的半固体状态的稠厚物质，失去流动性。这种现象称为胶凝作用，所形成的产物叫做凝胶或冻胶。2.电泳：带电颗粒在电场作用下，向着与其电性相反的电极移动，称为电泳(electrophoresis, EP)。利用带电粒子在电场中移动速度不同而达到分离的技术称为电泳技术。九、参考文献1 何忠效 ,张树政. 2009. 生物化学实验技术丛书: 电泳M. 北京:科学出版社.2 朱运峰
15、,冯东晓 , 李春海. 2008 聚丙烯酰胺凝胶电泳在 分离小分子物质中的应用 J. 生物技术通讯 , 9 ( 3 ) : 303 - 305.3 孙培龙 ,吴石金. 2008. 生物化学技术实验指导 : SDS-PAGE 测定蛋白质的相对分子质量M.北京:化学工业出版社.十、附录第一组原始数据记录表蛋白质相对分子质量 迁移距离 cm 质量对数 lgMw43000 0.7 4.6331000 1.5 4.4920100 2.05 4.314400 2.5 4.16A56234 0.35 4.75 28840 1.45 4.46 B45709 0.7 4.66 第二组原始数据记录表蛋白质相对分子质量 迁移距离 cm 质量对数 lgMw43000 0.3 4.6331000 0.7 4.4920100 1 4.314400 1.35 4.16A48978 0.2 4.6928840 0.7 4.46B43652 0.3 4.64
