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1、RAW264.7 细胞株的相关信息 ATCC: 美国模式培养物集存库(American type culture collection)的简写收到冷冻管细胞的处理方式1. 收到细胞株包裹时，请检查细胞株冷冻管是否有解冻情形， 若有请立即通知。细胞株请尽速开始培养，或立即冷冻保存(置于 70，隔夜后，移到液氮)。 2. 收到 T25 flask细胞的处理方式于寄送过程中，为避免起泡造成细胞脱落死亡，T25 flask 均加满培养基。2.1. 检查 flask 外观，并于显微镜下观察细胞生长状况和有无污染现象，若有任何问题，不要打开盖子，请立即通知细胞实验室。2.2. 将原封之 T25 flask
2、 静置于 37， 5% CO2 培养箱中，使细胞回温至 37，并让运送过程中少数脱落的细胞可再附着生长。2.3. 隔天后，于无菌操作箱内取出 flask内之培养基，(取出之培养基可以再使用)，仅留约 5-10ml 培养基于 flask 内，依一般培养方式再将细胞置入培养箱中，或细胞已长满盘， 则将细胞做传代培养。RAW264.7 细胞株的 Cell Culture一、RAW264.7 细胞培养的特点1、RAW264.7 细胞一般为圆形或椭圆形，功能活跃时，可呈多突形。细胞核为圆形或椭圆形，染色较深。贴壁特别牢固。2、RAW264.7 具有很强的吞噬能力，当吞噬抗原后，细胞会释放趋化因子，进一步
3、促进细胞伸出伪足，增强粘附攀爬能力。细胞吞噬抗原过多、培养环境恶劣都会促进该细胞呈现梭形、长梭形，镜下会看到具有细长伪足的小细胞被类似上皮的梭形大细胞取代。3、每次传代都很难消化下来。用力过大则对细胞损伤较大，这种细胞传代时接种密度要大，否则容易使巨噬细胞向终末细胞分化，细胞变成长形，并且不能回复，这是培养这种细胞时最需要注意的问题。4、对于 RAW264.7细胞他的声场时喜欢结伴。正常生长状态应该是一小片一小片的生长，片片之间不连接，等到长到更多更密的时候会连成大片，并且会叠加成层。所以，要很好地控制好细胞的生长速度，不要等到叠加成层的时候再传代。5、RAW264.7 细胞传代后贴壁时间较短
4、，半小时就能贴很多，刚贴壁是细胞呈圆形，折光度很好，镜下观察如小珍珠状一个个地散落于瓶底面。生长一段时间后，部分细胞会变成类似四角形，伸出伪足之类的。这个时候就是提醒你注意传代了，这部分细胞如再不传代，很容易就老化掉。二、RAW264.7 细胞传代1) 将培养瓶内旧的培养液弃掉， 然后用 D-Hanks液洗两次，(一定要洗干净，以免影响胰酶的消化作用) 2) 加入 0.25%胰酶-EDTA 消化，25cm 培养瓶加 0.4ml， 37 度消化 5min，镜下看到细胞变圆，间隙增大。 （值得注意的是该细胞对机械损伤比较敏感）3)立即加含 10%FCS的培养液终止消化，用细胞刮刀轻刮，注意，这时候
5、用吸管吹不下来，但是刮刀却很容易刮下来，而且对细胞的损伤极小4)离心，弃上清，加新的培养液(10%FCS)，小心吹匀，分装入新的培养瓶三、RAW264.7 细胞冻存及复苏（一）细胞冻存1. 配制冻存培养液；（通用的为培养基：血清：DMSO=7：2：1，但其中的血清可进行调整，如上面的仁兄用的 4：5：1，比例过高）2. 取对数生长期的细胞（冻存前一天换液），用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则直接将细胞移至 15ml离心管中；3. 离心 1000rpm，5min；4. 去除胰蛋白酶及旧的培养液，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密
6、度为 5106/ml1107/ml；5. 将细胞分装入冻存管中，每管 11.5 ml（不超过冻存管容量的 80%）；6. 在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者；7. 冻存：标准的冻存程序为降温速率-1-2/ min；当温度达-25以下时，可增至-5-10/min；到-100时，则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20冰箱 2h ，然后放入-70冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。（具体操作为4C 20min，-20C30min，-70过夜，转入液氮中）（二） 细胞复苏1. 从液氮容器中取出冻存管，直接浸入 37温水中，并不时摇动令其尽快融化。（1min 以内溶解完毕，不能
7、将口进入水面下）2. 从 37水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀；3. 离心， 1000rpm，5min；4. 弃去上清液，加入含 10%小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37培养箱静置培养；(复苏时细胞密度稍大，可提高复苏效率)5. 次日更换一次培养液，继续培养。（可更换一半培养液，避免跨度太大，影响细胞状态）（三）接种四、RAW264.7 细胞形态不好时的处理方法1.倒掉旧的培养基，加入 3ml新的培养基（有无血清的都可）洗涤一次，用滴管吸走，然后再加入 3ml的培养基，进行预吹打，控制吹打力度，轻轻地大概沿着瓶底过
8、一遍，然后吸走。这时侯再开始正式的消化、吹打。 2.把吹打下来的细胞悬液加入到新的培养瓶内，培养瓶事先加入培养基，放入培养箱内培养，按时间点观察细胞贴壁情况。10 分钟观察一次，20 分钟，30 分钟观察一次。选择一个时间点，已经有部分细胞贴壁的情况下，重新置于洁净台，底面朝上迅速倒出其中的培养基，加入 3ml新培养基再轻轻洗一次。然后加入完全培养基培养。后续观察细胞生长情况以及形态。我称之为“二传”。3.如果一次效果还不理想，可重复多次。直到找到细胞完美形态。其中要注意，结合细胞喜欢的生长情况。喜欢多一点数量长得好的细胞就等贴壁细胞比较多点的时候再传。反之亦然。不明之处：培养之前，一切与细胞
9、接触的玻璃器皿和器具都要进行过去热源处理。 （200-250烘烤 4-6h）？RAW264.7 细胞株 Cell Culture 的材料（一）仪器1. 净化工作台2. 离心机3. 恒温水浴箱4. 冰箱（4、-20、-70 ）5. 倒置相差显微镜6. 培养箱7. 液氮冰箱（二）玻璃器皿1. 吸管（弯头、直头）2. 培养瓶3. 玻璃瓶（250ml 、100ml）4. 废液缸（三）塑料器皿1. 吸头2. 枪头3. 胶塞4. 移液管（10ml）5. 15ml 离心管6. 冻存管（12ml）（四）其他物品1. 微量加样枪2. 红血球计数板3. 记号笔4. 医用橡皮膏5. 移液枪（五）试剂1. D-Han
10、ks 液2. 胎牛血清3. 培养液4. 双抗（青霉素、链霉素）5. 胰蛋白酶（0.25% ）6.7.4%NaHCO37. DMSO（分析纯）或无色新鲜甘油附 1. 胎牛血清品牌整理第一类，最高级别，是专门用于干细胞的特级胎牛血清1、Hyclone 的特级胎牛血清目前，性能最好的血清，还是要说说 Hyclone 的特级胎牛血清，货号是SH30070.03，它是 Hyclone 的“招牌菜”。Hyclone 特级胎牛血清（Defined FBS），货号 SH30070，是世界上唯一经过40 纳米过滤的顶级胎牛血清，极佳的促细胞生长作用及产品稳定性。内毒素含量10EU/ml，血红蛋白含量10mg/d
11、l 。此血清可以广泛用于各种细胞培养，包含任何干细胞系的培养。2、Gibco 的特级胎牛血清稍次一点的是 Gibco 公司在美国原装生产的特级胎牛血清，这款血清，货号是16000-044，是 100nm 过滤 3 次，内毒素和血红蛋白含量都可以与 Hyclone的 SH30070.03 相媲美。也可以用于培养大部分的干细胞系。同样是美国来源，所以渠道特殊。3.TCB 的特级胎牛血清TCB（Tissue Culture Biologicals）公司作为一家生物行业类的著名供应商，成立于 1978 年，大部分血清的采集和加工都在加利福尼亚。每一批的原材料都经过严格筛选，所有的产品都在 FDA 认证
12、的 cGMP 车间进行！4. Bioind 特优级胎牛血清血源来自北美和澳大利亚 BioInd 公司的生产完全符合 GMP 的要求，并通过ISO9000:2001 和 ISO 13485:2003 质量认证。以安全，稳定，高效为原则的BioInd 公司，所有的产品质量均完全符合国际标准。Biological Industries 主营细胞培养类产品，BioInd 工厂加工的胎牛血清均符合 USDA 标准及欧洲标准血清。根据美国农业部标准，原始血清均采自未发生疯牛病（BSE）和口蹄疫（FMD）疫情的国家。 Biological Industries 三步滤菌处理法，最后的过滤步骤为连续通过三个
13、100 纳米的滤膜。血清生产的洁净级别为 100 级。所有分装工作台都通过高效微粒空气过滤器过滤，并保持正压分装环境要对总微粒、悬浮微粒数和压力进行监控。分装之后，终产品迅速-20 度冻存，并隔离，直到所有的质量控制检测完成。第二类，优等胎牛血清1.Hyclone 的加拿大优等胎牛血清性价比最高的是 Hyclone 加拿大优等胎牛血清（CharacterizendFBS ）SH30396.03 血清采自加拿大，由 hyclone 公司总部的员工采集加工，采集方法，加工过程，检定标准与美国原产优等胎牛血清完全一致，市场价格低于美国原产的。经过 3 次 100nm 过滤，内毒素含量25EU/ml，
14、血红蛋白含量25mg/dl2、Hyclone 的南美优级胎牛血清大体与加拿大的优等血清是一样的，级别也非常相似，货号是 sv30087.02，该胎牛血清来源于南美洲，以封闭的心脏穿刺方式采集，产品经 3 次 100nm 过滤，经严格检测确保无支原体，细菌病毒检测依据美国药典（USP）和美国联邦法规第九篇（9CFR），内毒素含量10 EU/ml，血红蛋白含量20 mg/dl，完全符合美国 HyClone 优等胎牛血清的检测标准。3、Gibco 的澳大利亚胎牛血清情况和 Hyclone 的澳大利亚胎牛血清差不多，市场价也是 3200 元/500ml 左右。这一级别的血清，也能用于干细胞培养，可是，
15、不象特级胎牛血清那么优秀。因为，此胎牛血清属于澳大利亚生产的，不在疫区，可以正常报关进口，目前没有受到任何影响，所以，就目前而言，算是最好的胎牛血清了，有不少客户都此血清来培养干细胞，效果还是比较不错。4、TCB 的优级胎牛血清情况和 Hyclone 的澳大利亚胎牛血清差不多，市场价也是 2300 元/500ml 左右。这一级别的血清，也能用于干细胞培养，可是，不象特级胎牛血清那么优秀。第三类，一般级别的进口胎牛血清1、Hyclone 的南美胎牛血清目前，市场上用的最多的 Hyclone 血清是南美胎牛血清(FBS)SV30087 ，此血清采自南美，在国内（兰州）过滤并测试检验，经三次 100
16、 纳米过滤，根据中国商标法的规定标贴中文标签，内毒素含量10EU/ml,血红蛋白含量20mg/d 。此血清广泛用于各种肿瘤细胞的培养，还没有资料记载能够用于干细胞，也听说有少数人用于干细胞培养的，不过，因为本身血红素比较高，所以，最好不要用于干细胞，2、Gibco 的南美胎牛血清这款血清，是 Gibco 针对 Hyclone 南美胎牛血清做的，价格比较贵，好像是1780 元/500m。3、Gemini 的胎牛血清4、TCB 的胎牛血清5、PAA 的胎牛血清6、JRH 澳洲胎牛血清第四类，国产的各种系列胎牛血清国产的胎牛血清，国内没有严格意义的胎牛血清，胎牛血清本身是需要穿刺取血的，而国内都是剖腹产出胎牛，8 小时左右取血，然后，进行过滤分装。所以，国产的胎牛血清不是严格意义的胎牛血清。价格便宜但是遇到的问题非常多。附 2. Hyclone 液体培养基普通液体培养基列表描
