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1、RT-PCR实 验 步 骤一 、 总 RNA 提取1. 取 200mg 组织，放到 1.5mlEP 管中，加入 1mlTrizol 剪碎。 2. 震荡 30s。 3. 加 0.2ml 氯仿，剧烈摇动 30s，室温 3min。4. 12000g，4离心，15min。5. 吸上层无色水相，移入另一 EP 管中（约 0.5ml）。 6. 加等体积异丙醇，-20，30min。 7. 12000g，4离心，10min。在管底部可见微量 RNA 沉淀8. 弃上清，加 75%乙醇 1ml，振荡。 9. 7500g，4离心，10min。 10. 弃上清，用滤纸小心吸取残留液体，室温干燥 5-10min。11.
2、 沉淀溶于 20lDEPC 水，取 1l 加入 79lDEPC 水测OD260/OD280 12. 计算浓度与纯度，-70保存。2、逆转录合成 cDNA 第一链 反应体系如下混匀快速离心一次反应条件如下：-20冰箱冻存3、PCR 反应混匀快速离心一次反应条件如下：PCR 产物-20冰箱保存 取 PCR 产物 8l 加 5Loading Buffer 2l 2%琼脂糖凝胶电泳 120V。 100mA 30min 溴化乙锭染色，凝胶成象仪成象并保存结果。RT-PCR 实验方法总结 1,2 RT-PCR 实验有三步：抽提 RNA，RT，PCR 。 要求： 1.做 RT 前必需测 RNA 浓度，逆转录
3、体系对 RNA 量还是有一些要求，常用500ng 或 1ug。 2. RT 按要求做，一般不会出太大问题。 3. PCR，按常规。但如需扩长片段，则对前两步要求较高，需要有完整的cDNA 存在，不是单改变 Mg2+浓度、退火温度能解决的。 1）RT 和 PCR 时的引物设计是不是一定要先知道目的基因的序列？必须 在 RT 时，引物设计有 3 种方法即 a：Random 9mers；b：Oligo dT-Adaptor Primer；和 c：特异的下游引物。如果用 a 和 b 方法，是扩增的所有的cDNA（理论上），还要用此产物做 PCR 的模板继续扩增。 如果用 c 方法，那么要去那里查它的序
4、列呢？http:/www.ncbi.nlm.nih.gov 问题：在 做 RT-PCR 遇到一怪现象，即对同一动物不同组织扩增同一段基因，结果从一种组织中可以扩出我的目的基因，条带非常的好，而另一组织在同样的条件下却得 到许多非特异性的条带，尝试其他条件同样无法得到满意的结果，百思不得其解！（注：已肯定该基因在两种组织中都表达，且内参照在两种组织都可扩增出来） 从这两种组织中提取的 RNA 的量是不一样的，我测过吸光度，差异还很大，会不会和这有关呢？ 请高手指教！ 解答： 1.RT-PCR 有两种做法： 条件具备的话可用 kit 进行一步法进行；若条件不太好的话可分两步进行逆转录再 PCR。但
5、后来发现两步法的结果更加理想，条带特异性强且无拖尾现象，我推测是体系更加单一比较利于 PCR 的进行，当然也可能是我买的 kit 不太好。（promega）。 2.RT-PCR 应具备的条件 高质量的 RNA（保留后可做 5，3RACE）；引物的（最好产物短点）；若涉及粗略定量的话还应考虑 RNA 的浓度或是 cDNA 的浓度（如果由内标分子更好，但我发现其实很不容易将 RNA 的浓度以及内标分子的表达量调整的完全一样）；体系的均一性等。 3.RACE 我 做过 RACE（3RACE 是宝生物的 Kit；5RACE 是 Gibico），但现在再进行另一个同源基因的 3RACE 时却怎么也 P
6、不出来，这两个基因 是由同一对引物扩增出来的，其中一个已经获得了全序列（RACE 的方法），而另一个基因的 3UTR 却增么也扩不出来，我推测是不是该基因的 3UTR 太 长的缘故，我都快绿了，有无 RT-PCR 的常用内标 bactin 和 GAPDH 的使用有选择性吗？比如不同的细胞，不同的刺激。 有关内参： RT-PCR 内参照可以在一个管子里做（那样也是图好看一些），最好分开两管，把除了引物之外的 mixture 统一配，拍照后，算目的基因和内参的比值，这就是基因表达的相对浓度。 问：我曾经作过同一管的 PCR，内有 actin 和目的基因引物。虽然可见到两条均一条带但图片质量不理想（
7、而且酶量、Mg2+加倍）。请教 mxbdna2003 ，你是如何处理同一管的 PCR 的各成分的浓度？ 答：it should determined the amount of RNA. but it not for the quantitity of the PCR. it just was convienent to guess the amount ot the template(for RT and PCR) and bettrer for publication and editor if he don not know the preocedure much. but the am
8、ount justusing accurate piptte is wrong. it shoud be remembered to do the inner control of housekeeping gene everytime. 在同一管中做 RT，其实没有什么问题，不需要 taq 魅加量，taq 酶本来就是过量的-，（平时做 pcr 的时候，完全可以再省一些 taq 酶的，半斤八两就可以了，我想这肯定再很多贴子里应该都谈到了。Mg 就跟不能变了，一变整个体系就变了。能看到均一条带就很好了。 关键是摸，十八摸（太少，只争朝夕，开个玩笑）虽然用不着，但是摸上 3、5摸总是必要的，首先遥
9、分开摸，然后再一起摸，直到摸的好了，还要考虑比较的不同的模板中的量，所以我们不建议再同一管中进行，因为还有互相竞争抑制的问题，即使不同基因之间。 有关内参的建议：一定要做内参的，每一次，我想。不作内参的结果是不可信的 电 泳可以不一起跑，没有关系，计算的是相对表达程度，着我在好几封帖子里都谈了，再说一边我得观点，1、半定量和定量 RT-PCR 做的都是基因相对表达量， 不是绝对表达量，除非你能准确知道来自多少细胞，但是细胞还有死的呢。2、以电泳为基础的半定量 RT-PCR 本身是不可信的，作为实验的粗筛是可以的，但 不能作为最终结果的，3、半定量 RT-PCR 应该再两管中进行，除非内参基因和
10、目的基因表达相同，长度差不多，GC 含量相似，或者实在穷的要省 PCR管和 taq。 关于平台期和线性期的问题，实际上线性期是指数期，只不过碰巧 2 的冥和 2的倍数是相同的。看上去任何一个时期都可以，实际上是不对的， 因为牵涉到酶促动力学的问题，这个我也不懂，有一些专门的文章，好像，涉及到很多化学的东西。我们学医的，也没必要知道那些，但是其中主要是因为模板引物 酶原料和 buffer 之间的关系，这种反应单*改变其中一种成分没有用的，酶一直是过量，再加酶也没用，引物 ntp 都是这样。烟鬼正传，最好选线性期的开 始阶段，但是要在你的凝胶成像分辨范围内，所以选一个这两种的契合点。给你一张图你就
11、明白了，再开始的时候酸的是切线，这图我在 * 帖过。 关于引物设计，再可能的情况下，除了常规要求之外，最好兼顾跨内含子（不过，根据要求，还可以专门设计隔内含子的，这样还可以用于基因组 PCR）、长度小于 500bp600bp 等等。 引物当然要设计成一样的退火温度，即使不再一管中，也要一样的，要在一台机器里啊。我的引物占了冰箱一格，大部分是一个温度，这样任何几个都可以拿来披，也不用查。 我反复说过了，别用软件，就用眼睛看，软件涉及的在好，有些基因在它出软件的时候，还没发现呢，跟不要说在基因组的位置和序列了，怎么考虑内含子的问题呢？ 18s 的引物也和著名的 actin 一样是设计的，只要拿到序
12、列就可以了，但是限制是只能用总 RNA 为模板，但是比 actin 和 bubulin 等可准多了，更不 要说GAPDH 这个破烂了。18s 除了在细胞中更相同（量）外，主要是它占的比例远远高于看家基因，所以定量更加准确，我想，不知对不对，请几位主任和eeflying 指教。我认为，就像你用某一种东西的数量去概括，因该选那种多的东西，说一座房子是由 2000 块砖造成的，比说又 29 根梁更准确吧。更不 要说没有看家基因不看家的缺点，因为他是服务于整个基因组表达谱什么的。 PE 有专门的用于实时 PCR 的内参试剂盒，就是用 18s，不过我们看懂使用的那条序列，不知有没有人用过，告知其序列和
13、genbank 号。 正好问一下，我查了一些序列，一直没有去合成，主要是因为手上的 actin 的荧光探针还没有完，当初和成了一堆。 有那位高手用过 18s 的内参，请问您的序列（我指的是模板的序列）？ 原位杂交最好用 RNA 做探针，效果好一些，反正你有钱卖 roche 的盒子，而且量也能保证，因为转录过程嘛，沿着一条线突突地跑就是了。正义反义也容易理清。 我 觉得做 RT-PCR 的方法和条件及应注意的事项就是那么几条,许多专业书都有详细的描述,但是许多人还是历经多次磨难，有时就是得不出结果。因此，我认为 因为每个人所要克隆的片断不同，引物不同等，因此对不同的人来说还是有他自己的特殊性,我
14、的以下经历说明：做实验时各人的情况不同,做不出时还是要好好动 一下脑子。 记得我开始我的PCR 时，按常规方法，提取总后，首先用自己设计的下游引物进行逆转录，不断改变反应条件，进行了 次均没有结果。后来考虑到本人的克隆的 PCR 的片断位于我们实验另一位同学克隆的片断当中，而该同学已经用 RT-PCR 克隆出她的片断（尽管她用这些 产物做模版再进行时也没办法重复出她的产物），因此，我先用她的引物和条件扩增出她的片断，然后用她的产物作模板（有点改 进，逆转录反应换用了mers 随机引物），用我的引进物进行一般 PCR，终于得到我的产物，测序结果完全正确。尽管我的这个经历别人很人遇到，但足可以 说
15、明实验可以有自己的模式，书本的知识和别人的经验很重要，但有时也不定要受到书本框框和别人经验的限制 请问： 1 引物的特异退火温度怎样设定？可以根据 gc 和 at 含量算出吗？可以用引物报告单上的 Tm 值吗？ 2 PCR 时 20 微升体系中 cDNA 应加多少比较合适？ MgCl2 应加多少？各个成分的量有无确定标准？ 3 PCR 结果跑电泳，actin 有，但跑不出目的条带，有几种原因？与 cDNA 的量少有关吗？Mg 离子太多是否会抑制 Taqase 的活性？一般来说引物报告单伤得是对的,也可以自己算,实际上重要的各条引物一致,剩下的可以摸的. 20 中是指体积还是量?只要不明显改变体
16、系的离子强度,加 1,2ul都可以的.mg 要调的,但我总觉得没有书里讲的那么玄乎 ,我都是常年不变的. 如果内参照有,目的没有,至少证明不是美丽惹 的祸 .原因书里应该都说了. 在 所有 RNA 实验中，最关键的因素是分离得到全长的 RNA。而实验失败的主要原因是核糖核酸酶（RNA 酶）的污染。由于 RNA 酶广泛存在而稳定，一般反应不 需要辅助因子。因而 RNA 制剂中只要存在少量的 RNA 酶就会引起RNA 在制备与分析过程中的降解，而所制备的 RNA 的纯度和完整性又可直接影响 RNA 分析 的结果，所以 RNA 的制备与分析操作难度极大。 在实验中，一方面要严格控制外源性 RNA 酶的污染；另一方面要最大限度地抑制内源性的 RNA 酶。RNA 酶可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等。 外
