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1、1组织乙醛脱氢酶 2 活性比色法定量检测试剂盒产品说明书（中文版）主要用途组织乙醛脱氢酶 2 活性比色法定量检测试剂盒是一种旨在使用乙醛脱氢酶 2 敏感性抑制剂，通过检测反应系统中氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）还原后峰值的增高，即采用比色法来测定组织裂解萃取液样品中酶活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种组织裂解悬液样品（动物、人体等）乙醛脱氢酶 2 的特异活性检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。技术背景乙醛脱氢酶（aldehyde dehydrogenase；ALDH ；EC1.2.1.3） ，又称为乙醛NAD氧化还原酶（aldehy
2、de NAD- oxidoreductase）是一类 NAD（P ）依赖性酶，催化广谱的外源性或内源性脂肪族和芳香族乙醛类底物氧化，包括乙醇、氨基酸、生物胺（biogenic amine ） 、维生素、固醇类、脂质、药物和环境分子等代谢产物。 乙醛脱氢酶是乙醇在体内分解代谢过程中两种主要酶之一。乙醛脱氢酶把乙醛中的两个氢原子脱掉，使乙醛转化为乙酸，生成的乙酸进入脂肪酸氧化途径，最终被氧化成二氧化碳和水。乙醛脱氢酶主要有两种同工酶：ALDH 1和ALDH 2。ALDH 1存在于胞液中，ALDH 2存在于线粒体中，ALDH 2比ALDH 1的活性高。乙醛脱氢酶的缺少，使酒精不能被完全分解为水和二氧
3、化碳，而是以乙醛继续留在体内，使人喝酒后产生恶心欲吐、昏迷不适等醉酒症状。基于来自于乙醇代谢产生的乙醛（acetaldehyde） ，在7-羟基-3-（4-羟苯基）-异黄酮-7-糖苷（Daidzein-7-O-D-glucopyranoside；Daidzin）存在与否的情况下，由乙醛脱氢酶2的催化作用，转化为乙酸（acetic acid）产物后，通过测定反应体系中氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（oxidized reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NAD）转化为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine d
4、inucleotide；NADH）的变化（340nm 波长） ，来定量分析乙醛脱氢酶2的特异活性。乙醛脱氢酶2反应系统为：产品内容清理液（Reagent A） 毫升裂解液（Reagent B） 毫升缓冲液（Reagent C） 毫升反应液（Reagent D） 毫升底物液（Reagent E） 毫升阴性液（Reagent F） 毫升专性液（Reagent G） 微升产品说明书 1 份保存方式2保存 缓冲液（Reagent C） 、 反应液（ Reagent D） 、 底物液（Reagent E ）和 专性液（Reagent G）在20冰箱里；其余的保存在 4冰箱里； 反应液（Reagent D
5、）和 底物液（Reagent E）避免光照；有效保证 6 月用户自备1.5 毫升离心管：用于样品保存的容器15 毫升锥形离心管：用于样品制备的容器（微型）台式离心机：用于样品制备比色皿或酶标板：用于比色的容器分光光度仪或酶标仪：用于比色分析实验步骤一、样品准备1 手术取出动物组织，并秤重 500 毫克2 （选择步骤）放进预冷的 15 毫升锥形离心管3 （选择步骤）加入 xx 毫升 清理液（Reagent A）清洗4 （选择步骤）抽去清理液5 移入到一个液氮冻存管6 即刻放进液氮罐过夜7 次日从液氮罐里取出，即刻（最快速度）用研磨棒碾碎组织成粉末状（注意： 切莫使组织冻融 ）8 放进一个 15
6、毫升锥形离心管9 加入置于冰槽里的 xx 微升 裂解液（Reagent B） 10强力涡旋震荡 30 秒，充分混匀11放进冰槽里孵育 30 分钟，期间每 10 分钟强力涡旋震荡 30 秒（注意： 如需暂时停止，放进 70冰箱里储存备用 ）12即刻放进 4台式离心机离心 10 分钟，速度为 10000g 13小心移取上清液到新的无菌的 1.5 毫升离心管14移取 10 微升进行蛋白定量检测（注意： 建议使用 Bradford 蛋白质浓度定量试剂盒 GMS30030.1）15放进70的冰箱里保存或置于冰槽里备用二、测定准备1 开启并设定好分光光度仪（温度为 25）：波长 340nm，间隔 60 秒
7、，读数 5 次（共 5 分钟） ，并置零 2 从20冰箱里取出试剂，置于冰槽里融化； 底物液（Reagent E）避免光照； 缓冲液（Reagent C）置于室温下均衡温度三、背景对照测定31 移取 xx 微升 缓冲液（Reagent C）到新的比色皿2 加入 xx 微升 反应液（Reagent D）3 加入 xx 微升 底物液（Reagent E）4 在 25温度下孵育 3 分钟5 加入 xx 微升 阴性液（Reagent F）6 上下倾倒数次，混匀（限定在 3 秒之内）7 即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照（5 分钟读数0 分钟读数）四、样品总活性测定1 移取 xx 微升 缓冲液（Re
8、agent C）到新的比色皿2 加入 xx 微升 反应液（Reagent D）3 加入 xx 微升 底物液（Reagent E）4 在 25温度下孵育 3 分钟（注意：如果背景有波动，可以延长孵育时间 30 分钟）5 加入 20 微升待测样品（或 50 微克蛋白） （注意： 样品须清澈 ）6 上下倾倒数次，混匀（限定在 3 秒之内）7 即刻放进分光光度仪检测，此为样品读数（5 分钟读数0 分钟读数） 五、样品非特异活性测定1 移取 xx 微升 缓冲液（Reagent C）到新的比色皿2 加入 xx 微升 专性液（Reagent G）3 加入 20 微升待测样品（或 50 微克蛋白） （注意：
9、样品须清澈 ）4 上下倾倒数次，混匀5 在 25温度下孵育 10 分钟6 加入 xx 微升 缓冲液（Reagent C）7 加入 xx 微升 反应液（Reagent D）8 加入 xx 微升 底物液（Reagent E）9 上下倾倒数次，混匀（限定在 3 秒之内）10 即刻放进分光光度仪检测，此为样品读数（5 分钟读数0 分钟读数） 六、计算样品活性1）样品活性（总活性或非特异活性）2）样品特异活性七、 酶标板测定1. 背景对照和样品总活性41 在 96 孔酶标板上做好相应标记：背景对照、样品总活性2 分别移取 xx 微升 缓冲液（Reagent C）到 96 孔板中3 分别加入 xx 微升
10、反应液（Reagent D）4 分别加入 xx 微升 底物液（Reagent E）5 在 25温度下孵育 3 分钟（注意：如果背景有波动，可以延长孵育时间 30 分钟）6 分别加入 xx 微升 阴性液（Reagent F）或待测样品（或 10 微克蛋白）到相应孔中（注意： 样品须清澈 ）7 轻轻摇动酶标板8 即刻放进酶标仪检测：0 分钟读数和 5 分钟读数2. 样品非特异活性1 在 96 孔酶标板上做好相应标记：样品非特异活性2 移取 xx 微升 缓冲液（Reagent C）到 96 孔板中3 加入 xx 微升 专性液（Reagent G）4 加入 5 微升待测样品（或 10 微克蛋白） （注
11、意： 样品须清澈 ）5 轻轻摇动 96 孔酶标板6 在 25温度下孵育 10 分钟7 加入 xx 微升 缓冲液（Reagent C）8 加入 xx 微升 反应液（Reagent D）9 加入 xx 微升 底物液（Reagent E）10轻轻摇动酶标板11即刻放进酶标仪检测：0 分钟读数和 5 分钟读数3. 计算样品活性1）样品活性（总活性或非特异活性）2）样品特异活性注意事项1 本产品为 100 次（比色皿；50 个样本）操作，包括背景对照2 操作时，须戴手套3 用户可以直接使用线粒体裂解悬液检测更佳，减少干扰4 由于 II 型活性本身较低，如果总蛋白检测干扰过大，建议进行样本背景对照或采用线
12、粒体样本5 如果直接使用线粒体样本，则可以省去非特异活性检测6 系统操作过程中，背景测定只需 1 次7 建议使用比色皿测定8 样品须澄清，至关重要 59 加样后 3 秒内比色测定10测定值由低到高变化；测定可持续 5 分钟11比色测定后，比色皿须清洗彻底12样本测定 5 分钟读数高于 0 分钟读数表明具有酶活性13建议待测样本蛋白浓度为 50 微克/20 微升 （本公司提供 Bradford 蛋白质浓度定量试剂盒GMS30030.1） 14如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度15乙醛脱氢酶 2 单位活性定义为：在 25，pH 8.0 条件下，每分钟内能够转化 1 微摩尔氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH ）所需的酶量作为一个活性单位16本公司提供系列乙醇代谢酶类检测试剂产品质量标准1 本产品经鉴定性能稳定2 本产品经鉴定检测敏感
