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1、Oasis HLB 固相萃取-超快速液相-三重四极杆质谱法测定花生和花生油中黄曲霉毒素 B1、 B2、G1 、G2 劳 哲，江恩源，（梧州市疾病预防控制中心 广西梧州 543002）摘要：目的建立了 Oasis HLB 固相萃取- 超快速液相-三重四极杆质谱法测定花生和花生油中黄曲霉毒素 B1、B2、G1 、G2 的方法。方法样品用甲醇-水（V:V=20:80）提取，离心后过 Oasis HLB 柱萃取净化，超快速液相进行梯度洗脱，质谱用电喷雾离子源（ESI）,经过正离子 MRM 模式，外标法定量。结果黄曲霉毒素(AFT) B1、B2、G1、G2 的最低检出限分别为：0.05、0.05、0.1
2、0、0.20g/kg，平均加标回收率在 89.3%98.7% 之间，精密度（RSD ）在 2.6%5.3%之间。结论本法利用 Oasis HLB 固相萃取柱良好的性能和质谱仪采用弯曲 180 度的碰撞池技术大大减少了样品中的杂质干扰，精密度和准确度高，方法操作简便，结果可靠。关键词：超快速液相；三重四极杆质谱；Oasis HLB 固相萃取；黄曲霉毒素Determination of Aflatoxin B1, B2, G1, G2 in Peanut and Peanut Oil by Oasis HLB SPE- Ultra Fast Liquid Chromatography-Triple
3、 Quadrupole Tandem Mass SpectrometryLAO Zhe，JIANG En-yuan(Center for Disease Control and Prevention of Wu Zhou，Guangxi Wuzhou ，543002)ABSTRACT: Objective A method for Determination of aflatoxin B1, B2, G1, G2 in pe-anut and peanut oil by oasis HLB SPE-high performance liquid chromatography-triple qu
4、a-drupole tandem mass was established.Methods The sample undergoes methanol-water (V:V=20:80) extraction, extraction purification through Oasis HLB Cartridge after centrifugat-ion. Gradient elution of liquid chromatography, ESI is applied as mass spectrum, which is subject to positive ion MRM mode a
5、nd quantitation with external standard method. The minimum detection limit for AFT B1, B2, G1 and G2 are respectively:0.05,0.05,0.10 and 0.20ng/mL.Results the average recovery rate of standard addition is 89.3%98.7%, RSD is 2.6%5.3%. Conclusions By optimizing sample extraction conditions, precision
6、extra-ction of Oasis HLB SPE and collision cell with a 180 degree are adopted to greatly redu-ce the impurity interference in the sample, and increase precision and accuracy. It can ob-tain reliable results with simple operation.KEY WORDS: ultra fast liquid chromatography; triple quadrupole tandem m
7、ass spectrometry; Oasis HLB solid phase extraction; aflatoxin 黄曲霉毒素(AFT)是食物及饲料中寄生的黄曲霉、寄生曲霉代谢的化学结构类似的一组产物，在潮湿温热地区出机率最高。它含有双呋喃环和氧杂萘邻酮，双呋喃环为基本毒性结构，氧杂萘邻酮与致癌性有关。接触浓度高时可导致肝癌甚至死亡。目前，测定食品中 AFT 的方法有酶联免疫法 1、薄层层析法 2、微柱筛选法 3、免疫层析法 4、金标试纸法 5、免疫亲和柱净化液相色谱法 6、液相色谱 -质谱法 7等。国家标准 GB/T 5009.24-2011 中推荐的检测方法是的薄层色谱法和微柱筛选
8、法 8。酶联免疫法操作的人为误差较大,主要应用于样品筛选和定性分析。薄层层析法和免疫层析法需要人工制作层析板，要手动进行点板和有机溶剂展开，操作过程复杂，重现性差。金标试纸法只适合快速定性测定，定量准确度差。微柱筛选法所需的微柱层析管必须要随装随用，柱管很容易在空气中吸水导致活性下降影响吸附率，使检测结果不够稳定。免疫亲和柱净化液相色谱法由于免疫亲和柱受温度影响大，太高或太低的温度都会对亲和柱的回收率有一定的影响，而且价格较高，不适合基层单位进行大批量分析样品。Oasis HLB 吸附剂是由亲脂性二乙烯苯与亲水性 N-乙烯基吡咯烷酮两种单体按一定比例聚合成大孔共聚物。保留机理为反相，通过特殊的
9、极性捕获基团（极性钩）增加对极性物质的保留提供良好的水浸润性。可用于中性、碱性和酸性化合物的通用型吸附剂，回收率高而稳定 9。根据资料分析，Oasis HLB 固相萃取柱使用分析效果较好，价格比免疫亲和固相萃取柱便宜很多，更适合大批量检测。本文采用 Oasis HLB 固相萃取- 超快速液相-三重四极杆质谱法测定花生和花生油中黄曲霉毒素 B1、B2、G1 、G2。 1材料与方法1.1仪器与试剂AB SCIEX TripleQuad-3500 质谱仪（带 ESI 离子源） ；Shimadzu Nexera XR 超快速液相色谱仪；Waters Oasis HLB 固相萃取柱（3cc，60mg）
10、；全自动固相萃取仪（上海屹尧 EXTRA） ； Vortex-Genie2 涡旋振荡器；Cence-H1850 高速离心机；力德 LAA-10-L 超纯水机；氮吹浓缩仪（上海屹尧 N1） ；0.22m、0.45m 滤膜+抽滤头（有机相） ；乙腈（TEDIA 色谱纯） 、甲醇、甲酸、正己烷（ Merck 色谱纯） ；氯化钠（西陇化工优级纯）；IKA A11 研磨机；黄曲霉毒素总量免疫亲和柱（北京华安麦科生物技术有限公司） ；黄曲霉毒素 B1、B2、G1、G2 标准物质（农业部环境保护科研监测所 SB05-195、196、197、198-2008） ；黄曲霉毒素标准样品 Level#AC-274；
11、Level#AC-270 （新加坡普瑞邦公司，Grade PRIBOLAB, aflatoxin in maize flour oekanal analytical standard） 。 1.2提取准确称取 5.00g 研磨均匀的花生或花生油样品至 50mL 塑料离心管中，加入5mL 正己烷、5mL 超纯水、2g 氯化钠充分震荡均匀后加入 10mL 甲醇- 水（V:V=20:80）提取液，在涡旋振荡器高速震荡（300r/min）10min，以 11000r/min 离心 5min，花生样品收集上清液（花生油样品用带针头的注射器收集下层清液）于 50mL 比色管中。残渣中再加入 10mL 提取
12、液再提取一次，合并提取液用注射器吸取后推出通过抽滤头（0.45m 滤膜） ，滤出的清液备用。1.3 净化过全自动固相萃取仪设定程序为：用 10mL 甲醇活化 Oasis HLB 固相萃取柱，6mL 纯水平衡柱子；将收集的滤出的清液经上样：10.0mL，流速：1.0mL/min；淋洗：3.0mL 的甲醇-水（5:95） ，流速：1mL/min；用 2.0mL 空气吹干；洗脱：5.0mL 甲醇洗脱，流速：1.0mL /min；洗脱液于定量浓缩仪内用氮气吹至近干，用 1.0mL 乙腈溶解，用注射器吸取后推出通过抽滤头（0.22m 滤膜） ，滤出液用乙腈定容至 1.00待上机分析。1.4 液相色谱条件
13、色谱柱：Shim-pack XR-ODS（75mm 2.0mm，2.2m） ；流速：1.0mL/min；进样体积：10.0L；柱温： 30；流动相：A 为水（0.2% 甲酸） ；B 为乙腈；梯度洗脱程序：02min，20%B；25min，20%B95%B；59min，95%B；910min，95%B10%B；1012min，10%B。1.5 质谱条件电喷雾离子源正离子扫描（ESI ） ；多反应监测模式（MRM） ；喷雾电压（IS）:5500V；气帘气压力（CUR）：20 psi；碰撞气压力（ CAD）：8 psi ；雾化温度（Temp ）：600；雾化气压力（Gas1 ）：55 psi ；辅助
14、气压力（Gas2）：60 psi。黄曲霉毒素 B1、B2 、G1、G2 的质谱优化条件设置见表 1。表 1 黄曲霉毒素 B1、B2、G1、G2 的质谱优化条件设置化合物 母离子/m/z 子离子/m/z DP/V EP/V CE/V CXP/V AFT B1 313.1 285.1（目标） 100 10 33 15 241.0（参考） 100 10 50 15 AFT B2 315.0 259.0（目标） 100 10 40 15 287.0（参考） 100 10 36 15 AFT G1 329.0 243.0（目标） 110 10 36 15 200.1（参考） 110 10 56 15 A
15、FT G2 331.1 313.1（目标） 95 10 35 15 245.1（参考） 95 10 42 15 备注： DP: 去簇电压；CE: 碰撞能；EP 碰撞室入口电压；CXP：碰撞室出口电压。2结果2.1 检测黄曲霉毒素 B1、B2、G1、G2 标准溶液得到 MRM 质谱图按照表 1 的质谱优化条件，以多反应监测模式（MRM）检测 5g/L 的黄曲霉毒素 B1、B2、G1、G2 混合标准溶液得到 MRM 质谱图见图 1。图 1 5g/L 的黄曲霉毒素 B1、B2、G1、G2 混合标准溶液 MRM 质谱图多反应监测模式（MRM）的工作原理是先检测具有特异性的母离子，然后只将选定的特异母离子进行诱导碰撞，去除其他子离子干扰，只对选定的特异子离子进行质谱信号采集。以目标离子对和参考离子对的保留时间和特异的离子质谱响应信号进行定性，以目标离子对的峰面积进行定量。黄曲霉毒素 B1、B2 、G1 、G2 的目标离子对的保留时间分别是：2.55min；2.47 mi
