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1、1疟原虫基因转染的研究进展关键词：恶性疟原虫；PlasmodiumfalciparumP.f；基因转染；病原生物 随着恶性疟原虫（Plasmodiumfalciparum,P.f）2 号1 、9号2和 3 号3染色体序列的相继明了，关于 P.f 基因组的研究大大向前迈进了一步，在未来的 23 年内，将有可能对其全部基因组序列分析完毕。毫无疑问，疟原虫研究即将或已经进入后基因组时代4。对疟原虫各种基因及其基因产物的功能研究是发现有效疫苗和抗疟药物作用靶位的必要前提，但许多基因的功能，尤其是与疟原虫致病力有关的重要基因的功能尚未得以阐明，因而影响了疟疾的防治工作。以往的基因功能研究局限于与已知功能
2、基因的比较和间接地推测，近年来发展的疟原虫基因转染技术5可通过改变基因后观察表型变化在活体研究基因的功能，使疟原虫基因的研究现状大为改观。不仅如此，该技术也使疟原虫基因表达调控、药物抗性研究、细胞生物学以及疫苗的研究均出现了崭新的技术性变化。在四种感染人的疟原虫中，P.f 的致病性最为严重，其研究历来倍受重视，本文就疟原虫（主要是 P.f）基因转染方面的研究作一综述。 1疟原虫基因转染的种类 1.1 短暂转染 自 70 年代末 Hinnen 等6建立酵母转染技术以来，真核细2胞的转基因技术在基因调控和基因功能的研究中起到了极其重要的作用。1993 年 Goonewardence 等7 首先进行
3、了疟原虫基因转染开创性的工作，为疟原虫基因转染技术的不断发展和广泛应用奠定了基础。作者将虫荧光素酶（fireflyluciferase）基因插入鸡疟原虫（Plasmodiumgallinaceum,P.g）有性期基因 pgs28 的编码区，构成嵌合基因后克隆入质粒载体 pUC13，以电穿孔法导入 P.g 的雌配子和受精的合子，24 小时后检测到虫荧光素酶的短暂表达。两年后，Wu 等8报导了 P.f 环状体的短暂转染。将外源氯霉素乙酰转移酶（chloramphenicolacetyltransferase,CAT）基因分别置于P.f 热休克蛋白 86（heatshockprotein86,HSP
4、86）的 5和 3侧翼序列，或富组氨酸蛋白 3（histidine-richprotein3,HRP3 ）的5侧翼序列和 HRP2 的 3侧翼序列等基因调控序列的控制下，也检测到外源 CAT 在 P.f 的短暂表达。 短暂转染常用于基因调控的快速分析，通过报告基因的转录表达即可分析调控基因在基因表达调控中的确切作用。但在很多方面的研究和应用中稳定转染是必需的。 1.2 稳定转染 与短暂转染不同，稳定转染（或转化）后将由于外源 DNA的表达导致细胞表型的永久改变。 1.2.1 附加体型的稳定转染 一般而言，以环状质粒进行转染主要导致附加体的自我复制。在有药物作用时，环状质粒可以附加体的形式稳定存
5、在（若延长给3予高浓度药物作用，部分质粒可与受体细胞基因组整合） ；当去除药物作用时，附加体将由于随机分离而不稳定，并在细胞分裂中丢失912 。所以，这种“稳定”是相对的、有条件的。 vanDijk 等11转染伯氏疟原虫（Plasmodiumberghei,P.b）裂殖子时发现，在药物作用下质粒在受体细胞内以环状、非重组型附加体进行复制，虽然每个细胞中质粒拷贝数可高达 15 个，但未发现质粒与基因组的整合。 1.2.2 整合型的稳定转染 在 vanDijk 等转染 P.b 之后，Wu、Crabb、Vanderwel 等分别对 P.f 和 P.k 进行转染，均得到了稳定的整合型转染子10、12、
6、13。尤其在 1997 年，Crabb 等14构建了一系列具有CAT 基因和鼠弓形虫(Toxoplasmagondii,T.g)的二氢叶酸还原酶胸苷合成酶(dihydrofolatereducease-thymidylatesynthase,DHFR-TS)双功能基因的变异体乙胺嘧啶(pyrimethamine,pyr)抗性相关酶、但定位方式不同的质粒载体，转染 P.f 环状体再以 pyr 筛选以获得稳定的转染子，并系统地分析了不同的启动序列和终止序列对外源基因表达的影响，使疟原虫稳定转染技术趋于成熟，为进一步研究疟原虫生物学特别是基因功能打下了坚实的基础。 2 疟原虫基因转染的方法学 2.2
7、.1 疟原虫转染载体的主要构件 用于疟原虫转染的载体根据不同的用途包含的构件有所差异，其中主要的有调控序列、报告基因和筛选标记。 4基因转染中阳性转染子的筛选依赖于载体中选择基因的表达，而选择基因的表达又依赖于其侧翼区的调控序列。在疟原虫的基因转染中，该调控序列可以是同（种）源或异（种）源的，包括 5区和 3区，前者提供启动子和 5非翻译区(untranslatedregion，UTR） ，后者提供 3UTR 和转录终止信号。用于 P.f 的调控序列有：CAM 的 5和 3、PfDHFR-TSR 的 5、P.chabaudi 的 DHFR-TSR5、HSP86 的 5、HRP3 的 5、P.f
8、 增殖细胞核抗原（proliferatingcellnuclearantigen,PCNA）的 5和 HRP2 的 312。 vanderWel 等13采用完全异源的调控序列（源于 P.f 或P.b 的启动子）和筛选基因（T.gDHFR-TSR 或 P.bDHFR-TSR）构建的载体转染 P.k 获得成功，表明这三个疟原虫种具有共同的基因表达调控信号。 报告基因的表达产物，往往具有便于测定的酶活性、直接或间接荧光等特性。通过对其产物活性的测定可以推知报告基因的表达强度，进而对表达调控的某种（些）因素获得一定的认识。好的报告基因应具有方便、可靠、敏感、线性、简单和动态等几个特点。目前应用于疟原虫
9、转染的报告基因有：虫荧光素酶7、CAT8 、绿色荧光蛋白(Greenfluorescentprotein,GFP)1417，其中后两者已在 P.f 表达成功。CAT 的活性需要 14C 氯霉素或 3H 乙酰辅酶 A和液闪计数仪进行定量，但对于大多数研究者而言，废弃同位素的处理受到严格的限制。虽然已经出现了 CAT 的荧光分析，但尚未得5到普遍应用。最近发现 GFP 可以作为真核细胞报告基因18，因其众多的优点（不加任何底物紫外线激发后就能产生荧光，荧光性质稳定，分子量小，对细胞没有毒性，使用方便，可进行活细胞实时定位观察）而被称为“活细胞的分子探针”19（也可利用 GFP 的荧光特性通过流式细
10、胞仪筛选阳性转染子） ，在生命科学研究中得到了广泛的应用，是研究活细胞生命现象的新途径。 目前在疟原虫转染中 DHFR-TSR 是最常用的也是最好用的抗性筛选基因，它可置于各种同源或异源调控序列下进行表达20。DHFR-TSR 可以是源于疟原虫的，也可以是源于 T.g 的，而一般后者作为筛选基因更好，因为它不但可减少与内源 DHFR-TS 的重组机率，而且可赋予转化子较高的 pyr 抗性。体外研究表明，含T.gDHFR-TSR 的 P.b 转化子与含 P.bDHFR-TSR 的 P.b 转化子相比，前者对 pyr 的抗性水平比后者高 10100 倍。当两种共转染入 P.k后，含 T.gDHFR
11、-TSR 的转化子在体内优先被选择9 、13、20 。 最近，Mamoun 等21报导了两个可用于 P.f 转染的新的筛选基因：bsd 和 neo。前者编码土曲霉的 blasticidins 脱氨酶，对blasticidinS 具抗性；后者编码转座元 Tn5 的新霉素磷酸转移酶，对 geneticin 即 G418 有抗性。但一些容易引起抗药性的药物则不能用于药物选择。 2.2 转染方法 目前在所有疟原虫的转染中主要采用电穿孔法。其原理是在高电压电场的作用下，细胞表面会形成临时性的微孔，外面的 DNA6分子即可进入细胞。所以，电穿孔技术实际上是一种物理学手段，而不是生物化学技术。不同种的疟原虫
12、在电转染时的条件有所不同，P.f 的转染条件为：2.5kV，25F，200，4mm 电转杯（Bio-Rad）8、9，或 0.31kV，960F ，0.2mm 电转杯22。 2.3 转染效率 VanWye 等23根据其 P.f 的转染实验首先估计疟原虫电穿孔法短暂转染的效率为 10-2 数量级，且可有 10 倍左右变化。曾有P.f1%的转染率，但在大多数实验室仅为 10-6。与 P.f 相比，弓形虫（Toxoplasma）的转染率较高，可达存活虫数的 5%。利什曼原虫（Leishmania）的转染率也仅为 10-4。danGoldberg 使用SuperfectTM(Qiagen)使 P.f 的
13、短暂转染率提高到 5%-10%4、2426。疟原虫转染时外源基因必须依次通过宿主红细胞膜、含虫空泡膜、疟原虫自己的细胞膜和虫体细胞核膜，因此，与其他真核细胞的基因转染相比，疟原虫的基因转染效率必然要低得多。 2.4 转染子的鉴定 转染后必须鉴定出阳性转染子才可对特定基因的功能进行相应的各项检测。附加体型转染子可通过 PCR、Southern 杂交和质粒回收实验，具特异性位点整合的 DNA 可通过 PCR 和 Southern杂交得以鉴定。此外，整合型转染子也可以用脉冲场凝胶电泳法分离疟原虫的 14 条染色体后的染色体分析来鉴定。质粒回收也可确认整合的发生及恢复基因组中整合位点的侧翼序列9。 7
14、3 疟原虫基因转染的应用 3.1 基因表达调控 如前所述，短暂转染多用于基因表达调控的研究。Crabb 和Cowman12以 CAT 作为报告基因，逐渐删除其 5侧翼序列，对PfCAM、PfDHFR-TSR 和 PfDHFR-TSR 的启动子进行分析，确定了维持高转录活性的最小区域和含有重要启动子成分的小序列，为以后质粒载体的构建提供了必要的条件。 有人以虫荧光素酶为报告基因对 P.g 动合子表面蛋白 pgs28的 5非编码区进行分析时发现，随着序列的缩短，蛋白的期特异性表达转为非期特异的连续表达，表明被删除部位含有期特异性表达元件24 。最近，Dechering 等27又对 P.f 有性期特
15、异性基因pfs16 和 pfs25 的启动子进行了分析，并发现了一种与其启动子相作用的反式作用因子蛋白。这是首次对 P.f 的基因调控过程做细致的研究。 3.2 基因功能研究 疟原虫转染技术在基因功能研究方面的应用主要是基因敲除5、28 。其原理是：利用活细胞基因组 DNA 可与外源性 DNA 同源序列重组的性质，对预先选择的目的基因进行定点修饰以达到改变基因组某一特定基因的目的。 在基因敲除研究中，最为引人注目的是对环子孢子蛋白(circumsporozoiteprotein,CSP)29、血小板反应素/血小板凝血酶敏感蛋白相关未名蛋白8(thrombospondinrelatedanony
16、mousprotein,TRAP)30和结节相关富组氨酸蛋白(knobassociatedhistidinerichprotein,KAHRP)31的敲除，通过敲除发现了这些蛋白出乎预料的功能。例如，敲除 KAHRP 后，P.f 失去形成结节的能力，恶性疟原虫红细胞膜蛋白1（Plasmodiumfalciparumerythrocytemembraneprotein1,PfEMP1）的定位也有改变，表明 KAHRP 在结节的形成、PfEMP1 的组织及细胞粘附中具有重要地位。 3.3 药物研究 特异性药物靶蛋白的过表达是药物抗性机制中比较普遍的一种，转基因表达可在实验条件下模拟重组虫体中药物靶蛋白的过表达，并分析其过表达的可能机制。也可用表达性载体构建疟原虫的cDNA 文库后转入疟原虫，然后以药物从中筛选相应的药物抗
