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1、瓜蒌皮黄酮类化合物体外抗氧化作用研究氧化也称氧化作用或者氧化反应,是指有机物在反应体系中引入氧或脱去氢的作用。氧化作用与人体的很多症状紧密相关,如:衰老、心血管疾病等。而氧化作用的发生,很多是由于自由基的存在而造成的。人体内的自由基可分为:氧自由基和非氧自由基氧自由基占主导地位,大约占自由基总量的 95%,包括超氧阴离子(0 2-)、轻自由基(OH-)、过氧化氢分子(H2O2)、氢过氧基(H02-)、烷氧基(RO)、烷过氧基(ROO)、氮氧自由基(NO)、过氧亚硝酸盐(ONOO-)、氢过氧化物(R00H)以及单线态氧( 102)等,它们又统称为活性氧(reactive oxygen speei
2、es,1ROS),都是人体内最重要的自由基;非氧自由基主要包括氢自由基(H)和有机自由基(R)等。因为自由基中存在孤对电子或不平衡电子,所以它们是极不稳定分子或原子。一般,活性氧往往产生于机体内的自然代谢或者机体外部化学物质的作用。活性氧可以通过链式反应攻击细胞内或者体液中的生物分子,如:蛋白质、DNA、脂质等,从而导致各种相关疾病的发生。本实验将就瓜蒌皮总黄酮提取物的体外抗氧化性能进行系统研究,为瓜蒌皮进一步开发利用奠定科学理论基础。1 材料与方法1.1 材料与试剂瓜蒌皮乙醇提取物无水乙醇、抗坏血酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、邻苯三酚、水杨酸、过氧化氢、硫代巴比妥酸、三轻基氨基甲烷(Tris)
3、,(分析纯)国药集团化学试剂有限公司铁氰化钾 三氯乙酸、三氯化铁、硫酸亚铁 (分析纯)沈阳沈一精细化学品有限公司、盐酸(分析纯)沈阳化学试剂厂 1,1-二苯基-2-苦基苯胁 sigma 公司 ，卵磷脂 北京奥博星生物技术有限责任公司1.2 主要仪器设备紫外可见分光光度计1.3 试验方法1.3.1 清除 DPPH 自由基的测定精确称取 DPPH 9.7mg,加入少量无水乙醇溶解后,以体积分数为 95%的乙醇溶液定容至 250mL,制成浓度为 0.2mmol/L 的 DPPH 溶液取 2mL 已配制的 DPPH溶液,分别加入 1mL 不同浓度的瓜蒌皮黄酮提取液,以 95%乙醇补足到 4mL,混匀,
4、放置 30min 后,在 517nm 处测定样品吸光值 As:,以 95%乙醇为空白对照,测定Ac(李春阳,2006).以蒸馏水作参比,Vc 为阳性对照,按下式计算清除率及 IC50清除率/%=(Ac-As)/Acx100式中:Ac 一空白的吸光度As:一样品的吸光度以样品浓度与清除率作图,根据拟合方程求出清除率为 50%时所需样品的浓度,即半数抑制浓度 IC5o.1.3.2 抗脂质体过氧化能力的测定1.3.2.1 试剂的配制1、脂质体 PBS 分散系(LLs):3oomg 卵磷脂溶解于 3omL 10mmol/LpH7.4PBS(磷酸缓冲液),冰浴震荡(李颖畅,2008;莫开菊等,2006)
5、。2、三氯乙酸(TCA)-硫代巴比妥酸(TBA)-盐酸(HCL)混合液:15gTCA,0.37gTBA,2.lmL 浓盐酸依序放入 1OOmL 水中(李颖畅,2008;莫开菊等,2006)。1.3.2.2 测定步骤分别于样品管中依次加入 1mL 卵磷脂溶液 (LLS)、lmL0.4mmol/L 硫酸亚铁、1mL 样品,混匀，避光,于 37水浴 60min,加入 2mLTCA-TBA-HCl 混合液,90-100水浴 15min,迅速冷却,以 30O0r/min 离心 10min,取上清液在 535nm 测定吸光度 As。空白管以 1mL 重蒸水代替 1mL 样品,操作方法同样品管,可测得空白管
6、的吸光度 Ac。参比管中以 1mL 重蒸水代替 1mL 卵磷脂,Vc 为阳性对照(李颖畅,2008;莫开菊等,2006;张尔贤等,1996)。按下式计算清除率及 IC50。清除率/%=(Ac-As)/Acx100IC50 的计算同 1.3.1。1.3.3 还原力的测定取不同浓度的瓜蒌皮黄酮提取液 1mL 于试管中,依次加入 2.5mL O.2mol/L磷酸缓冲液(pH=6.6)和 2.5mL 质量分数 l%K3Fe(CN)6混匀,于 55恒温水浴中温育 2Omin 后,迅速冷却,加入 2.5mL 质量分数 10%的三氯乙酸混合后,以300Or/min 离心 1Omin,取上清液 2.5mL,依
7、次加入 2mL 蒸馏水和 O.5mL 质量分数0.1%的 FeC13溶液,充分混合,静置 10min 后,于 700nm 处测定样品吸光度值 As:,吸光度越大,表示还原能力越强。空白管以 1mL 重蒸水代替 1mL 样品,操作方法同样品管,可测得空白管的吸光度 Ac。用蒸馏水作参比,Ve 为阳性对照(陈留勇等,2004)。还原力=As-Ac1.3.4 清除超氧阴离子自由基(02 -)的测定取 4.5mLpH8.2 的 50mmol/L Tris-Hcl 缓冲液,4.2mL 蒸馏水,混匀,于 25恒温水浴中保温 2Omin,取出后立即加入在 25预热过的 25mmol/L 邻苯三酚溶液 0.4
8、mL(以 10mmol/LHCl 配制,空白管用 10mmol/L HCl 代替邻苯三酚的 HCI 溶液),迅速摇匀后于 25恒温水浴中反应 5min,加入 8mmol/L HCl 1mL 终止反应,于 320nm 处测定样品吸光度 As。空白管以 1mL 重蒸水代替 1mL 样品,操作方法同样品管,可测得空白管的吸光度汉 Ac(Yen G.C,ChenH.Y.,1995)。以蒸馏水作参比,Vc 为阳性对照。按下式计算清除率及 IC50。清除率/%=(Ac-As)/Aex100IC50的计算同 1.3.1。1.3.5 清除轻基自由基(.OH)的测定利用 H2O2与 Fe2+反应产生OH，在体系
9、内加入水杨酸捕捉并产生有色物质,该物质在 510nm 下有最大吸收。反应体系中含 8.8mmol/L H2O2lmL,10mmol/LFeso4lmL,1Ommol/L 水杨酸-乙醇 1mL ,分别加入不同浓度瓜蒌皮黄酮提取液 1mL,最后加 H2O2启动反应,37反应 0.5h,在 510nm 下测定样品吸光度 As。空白管以 1mL 重蒸水代替 1mL 样品,操作方法同样品管,可测得空白管的吸光度 Ac(牛桂玲等,2009)。以蒸馏水作参比,Vc 为阳性对照。按下式计算清除率及 IC50。清除率/%二(Ac-As)/Acx100IC50的计算同 1.3.1。1.4 数据分析采用 DPS 统
10、计软件进行方差分析2 结果与分析2.瓜蒌皮黄酮清除 DPPH 自由基能力试验结果见图 1 和图 2。如图 1 和图 2 所示,瓜蒌皮黄酮对 DPPH 自由基的清除率随着浓度增加而增强,且具有明显的量效关系,Vc 亦是。瓜蒌皮黄酮对DPPH 自由基的 IC50为 16.09g/ml, Vc 的 IC50为 81.44g/ml,表明瓜蒌皮黄酮对 DPPH 自由基的清除率明显高于 Vc。说明瓜蒌皮黄酮对 DPPH 自由基有显著的清除作用。0 5 10 15 20 25 300102030405060708090黄 酮 浓 度 （g/mL）清除率（%）图 1 瓜蒌皮黄酮对 DPPH 自由基的清除作用F
11、ig. 1 The scavenging effect of flavonoids from pericarpium trichosanthis on DPPH radical.0 20 40 60 80 100 120010203040506070Vc浓 度 （g/mL ）清除率（%）图 2 Vc 对 DPPH 自由基的清除作用Fig. 2 The scavenging effect of aseorbie acid on DPPH radical2.2 瓜蒌皮黄酮抗脂质体过氧化能力试验结果见图 3 和图 4。如图 3 和图 4 所示,瓜蒌皮黄酮对由 F2+引发的卵磷脂脂质体过氧化具有明显的
12、抑制作用,抑制率随着黄酮浓度增加而增强,且具有明显的量效关系,vc 亦是。瓜蒌皮黄酮的 IC50为 0.46mg/mL，Vc 的 IC50为1.52mg/mL,表明瓜蒌皮黄酮抗脂质过氧化能力明显优于 Vc。说明瓜蒌皮黄酮具有显著的抗脂质过氧化能力。0 100 200 300 400 500 6000102030405060黄 酮 浓 度 （g/mL)抑制率（%）图 3 瓜蒌皮黄酮抗脂质体过氧化能力Fig.3 The capability of flavonoids from pericarpium trichosanthis on inhibiting lipid Peroxidation0
13、0.5 1 1.5 2 2.5 3010203040506070Vc浓 度 （g/mL ）抑制率（%）图 4 Vc 抗脂质体过氧化能力Fig. 4 The capability of ascorbic acid on inhibiting lipid peroxidation2.3 瓜蒌皮黄酮的还原力试验结果见图 5.如图 5 所示,一般情况下,样品的还原力与抗氧化活性有明显的相关性(YenG.C.,1995;DuhP.D.,1997).从图 5 可以看出,在一定浓度范围内,瓜蒌皮黄酮的还原力随着浓度增大而增强,且具有明显的量效关系,Vc 亦是。瓜蒌皮黄酮浓度为 0.2mg/ml 时,吸光度为
14、 0.667,而 Vc 浓度为 0.2mg/ml 时,吸光度为 0.775,表明软瓜蒌皮具有较强的还原能力,但低于同浓度 Vc 的还原力。瓜蒌皮黄酮还原力大约是的 Vc 还原力的 0.86 倍。说明瓜蒌皮黄酮对 Fe3+具有较好的还原作用,但稍差于 Vc。0 100 200 300 400 500 60000.20.40.60.811.21.41.6瓜 蒌 皮 黄 酮Vc样 品 浓 度 （g/mL）吸光度图 5 瓜蒌皮黄酮和 Vc 的还原力Fig.5 The redueing ability of flavonoids from pericarpium trichosanthis and as
15、corbic acid2.4 瓜蒌皮黄酮清除超氧阴离子自由基能力邻苯三酚自氧化的机理十分复杂,至今仍不很清楚。邻苯三酚在碱性条件下发生反应,在反应滞后 30-45 秒后,产生稳定浓度的超氧阴离子自由基(0 2-)与中间物(M),中间物 M 又与02 -反应,得到一种有颜色的中间产物,此产物在紫外有吸收,能够引起某一波长处吸光值的线性积累,从而来反映抗氧化剂的清除能力的大小。试验结果见图 6 和图 7。如图 6 和图 7 所示,瓜蒌皮黄酮具有清除超氧阴离子自由基的作用,清除率随着黄酮浓度增加而增强,且具有明显的量效关系,Vc亦是。瓜蒌皮黄酮的 IC50为 7.33mg/mL,Vc 的 IC50为
16、 0.39mg/mL。说明瓜蒌皮黄酮对超氧阴离子自由基有一定的的清除作用,但差于 Vc。0 2 4 6 8 10 122025303540455055606570黄 酮 浓 度 （g/mL)清除率（%）图 6 瓜蒌皮黄酮对超氧阴离子自由基清除能力Fig.6 The scavenging effect of flavonoids from pericarpium trichosanthis on superoxide anion radical0 100 200 300 400 500 60020253035404550556065Vc浓 度 （g/mL ）清除率（%）图 7 Vc 对超氧阴离子自由基清除能力Fig.7 The scavenging effect of ascorbic acid on superoxide anion radical2.5 软枣称猴桃黄酮清除轻基自由基能力轻自由基(OH)是一种氧化能力很强的自由基,可发生电子转移!夺取氢
