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1、广 州 医 科 大 学 硕 士 学 位 论 文 广 州 地 区 61 例 苯 丙 酮 尿 症 患 儿 苯 丙 氨 酸 羟 化 酶 基 因 突 变 分 析广州地区 61 例苯丙酮尿症患儿苯丙氨酸羟化酶基因突变分析Study on the mutation analysis of phenylalaninehydroxylase gene in 61 patients withphenylketonuria in Guangzhou研究生：李湘莲导 师 ： 廖 灿 教 授专 业：妇产科学中文摘要目的苯 丙 酮 尿 症 （ phenylketonuria， PKU; OMIM 261600） 是 最
2、 常 见 的 氨 基 酸 代谢 病 之 一 ， 呈 常 染 色 体 隐 性 遗 传 疾 病 ， 世 界 各 地 都 在 研 究 PAH 基 因 突 变 特 点 ， 以明 确 PKU 患 者 人 群 分 布 特 征 和 地 区 分 布 特 征 ， 为 PKU 的 诊 断 和 治 疗 提 供 帮 助 。 因此 ， 本 研 究 应 用 DNA 直 接 测 序 的 方 法 对 PAH 基 因 进 行 突 变 分 析 ， 以 了 解 广 州 地 区PAH 基 因 突 变 类 型 及 突 变 热 点 ， 有 助 于 PKU 患 者 的 早 期 诊 断 和 治 疗 ， 为 遗 传 咨 询和 产 前 诊 断
3、提 供 有 力 的 理 论 依 据 ， 进 一 步 丰 富 中 国 人 群 PAH 基 因 突 变 谱 。研究对象与方法1. 研究对象选 取 2009 年 1 月 至 2013 年 3 月期间就诊或转诊广州市妇女儿童医疗中心新 生 儿 筛 查 中 心 ， Phe 筛 查 阳 性 病 例 61 例 。 61 例 患 儿 中 ， 对 其 中 2 例 行 家 系1广 州 医 科 大 学 硕 士 学 位 论 文 广 州 地 区 61 例 苯 丙 酮 尿 症 患 儿 苯 丙 氨 酸 羟 化 酶 基 因 突 变 分 析分 析 。2方法1) 实 验 方 法 在 UCSC 数 据 库 中 提 取 基 因 组
4、DNA 序 列 ， 对 PAH 基 因 编 码 的 13个 外 显 子 及 外 显 子 -内 含 子 交 界 区 设 计 相 应 引 物 ， 并 进 行 PCR 扩 增 ， 然 后运 用 DNA 测 序 技 术 对 PAH 基 因 作 序 列 分 析 。2) 序 列 分 析 采 用 Chromas 软 件 作 序 列 分 析 ， Clustalx 软 件 作 序 列 比 对 ，参 考 PAH locus 数 据 库 （ http:/www.pahdb.mcgil1.ca） 命 名 和 定 义 新突 变3) 统 计 分 析 选 择 两 独 立 样 本 的 t-test， 检 验 水 准 a 0.
5、05， 用 SPSS13.0统 计 软 件 进 行 分 析 。结果1、 PAH 基 因 突 变 检 出 率 在 61 例 PKU 患 儿 中 ， 总 的 检 出 率 为 89.34%(109/122)。外 显 子 7 突 变 检 出 率 35.8%（ 39/109） 最 高 ， 其 中 突 变 频 率 最 高 的 3 种 突 变分 别 为 R243Q 9.84%(12/109) 、 R241C 9.02%(11/109) 以 及 EX6-96AG5.74%(7/109)。新突变的检出率为 9.83%（ 12/122） 。2、 突 变 类 型 在 61 例 PKU 患 儿 中 ， 共 检 出 5
6、3 种 不 同 的 PAH 基 因 突 变 ， 其 中 ，错 义 突 变 35 种，无义突变 6 种，剪接突变 5 种 ， 缺 失 突 变 3 种，沉默 剪接 突 变 1 种 ， 插 入 突 变 1 种 ， 沉 默 突 变 1 种 和 缺 失 /插 入 1 种 。3、 检 出 2 个突变等位基因的 49 例 , 检 出 3 个 突 变 等 位 基 因 的 1 例 ， 检 出 1 个突 变 等 位 基 因 的 8 例 ， 未 检 出 突 变 突 变 等 位 基 因 的 3 例 。4、 新 突 变 国 际 上 首 次 发 现 的 新 突 变 12 种 ， 分 别 为 S446G、 F392I、 F
7、331S、L293S、 H285R、 Y154X、 Q172H、 F161fsX24、 A246T、 R158G 、 Y166X和 H107R。5、 2 个 家 系 结 果 其 中 一 个 家 系 的 风 险 胎 儿 （ 同 卵 双 胞 胎 ） 诊 断 为 携 带 者 ， 遗传 来 自 母 亲 的 PAH 基因突变；另一个家系父母均为 PAH 基 因 突 变 携 带 者 ，先 证 者 和 胎 儿 经 测 序 检 测 均 为 PKU 患 者 ， 突 变 分 别 来 自 父 亲 和 母 的 PAH 基因 突 变 。2广 州 医 科 大 学 硕 士 学 位 论 文 广 州 地 区 61 例 苯 丙
8、酮 尿 症 患 儿 苯 丙 氨 酸 羟 化 酶 基 因 突 变 分 析结 论1、 获 得 了 广 州 地 区 PAH 基 因 突 变 谱 ， 其 中 R243Q、 R241C、 EX6-96AG 为 高频 突 变 ， 突 变 检 出 率 分 别 为 9.84%、 9.02%和 5.74%。2、 外 显 子 7 上 PAH 基 因 突 变 频 率 最 高 。3、 发 现 12 种 中 国 人 群 PAH 基 因 新 突 变 ， 进 一 步 丰 富 了 中 国 人 群 PAH 基 因 突 变谱 。4、 在 临 床 产 前 筛 查 中 应 建 立 一 套 PKU 筛 查 策 略 。关键词：苯丙酮尿症
9、；苯丙氨酸羟化酶；基因突变3广 州 医 科 大 学 硕 士 学 位 论 文 广 州 地 区 61 例 苯 丙 酮 尿 症 患 儿 苯 丙 氨 酸 羟 化 酶 基 因 突 变 分 析Study on the mutation analysis of phenylalaninehydroxylase gene in 61 patients withphenylketonuria in GuangzhouAbstractObjectivePhenylketonuria (PKU,OMIM 261600) is one of the the most common aminoacid metaboli
10、sm diseases, inherited in an autosomal recessive model.In order tomake clear the distribution of PKU in population and regions,many researchers inthe word are studying on the PAH gene mutations, which can provide diagnosis andtreatment for the PKU patients. In this study, we use direct DNA sequencin
11、g todetect PAH gene mutation, to understand the PAH gene mutations and the highfrequency mutation in Guangzhou.It is helpful for early diagnosis and treatment ofthe PKU patients . It could also provide information for the genetic counseling andprenatal genetic diagnosis, and enrich the mutation spec
12、trum of the PAH gene inthe Chinese population.Methods1.SubjectsDuring January 2009 to March 2013,61 patients diagnosed as PKU werecollected with Phe higher than 10 ng/dl.All the subjects were collected fromGuangzhou women and childrens medical center, including 2 Pedigree analysis.2.Methods1 Methods
13、: the DNA sequence of PAH gene was retrieved from UCSCdatabase. Primers were designed covering the PAH gene, and the 13 exons andexon-intron boundaries were PCR amplified, The PAH gene sequence was analyzedby direct sequencing.4广 州 医 科 大 学 硕 士 学 位 论 文 广 州 地 区 61 例 苯 丙 酮 尿 症 患 儿 苯 丙 氨 酸 羟 化 酶 基 因 突 变
14、 分 析2 Sequence analysis: the sequence results were analyzed by Chromas, sequencealignments were performed by Clustalx. The mutations detected were named referringto PAH locus database （ http:/www.pahdb.mcgil1.ca） .3 Statistical analysis: Two independent sample t test was used,with test levela = 0.05
15、, by SPSS13.0 statistical software.Results1 In this study, we identified fifty-three different mutations in total, includingthirty-five missense mutations, six nonsense mutations, five splice mutations, threedeletion mutations, one silent mutations, one silent/spice mutation and one deletion/inserti
16、on mutation.2 The frequency of mutations in exon 7 is the hightest (35.8%).The mostcommon mutations in this study were R243Q,R241C and R243Q,with frequencies9.84%,9.02% and 5.74% respectively.3 In the sixty-one patients, two mutations were identified in each of theforty-nine patients, one mutations were identified in eight patients, three pathogenicmutations in one patients and no pat
