ADICON Clinical Laboratories, Inc.艾迪康医学检验中心Standard Operating Procedure标准操作程序 AD No.编号: SOP-ET219 Version版本:10 Page页码 1 of 5Written by编 制 人 ： 钟 维 君 Date日期:2011-5-13 Effective Date生效日期: Reviewed by审核者：Distribution Scope发放范围：研发部特检实验室Approved by批准人：Refer to addendum for document user approval and annual review information 文件使用批准和年度审核信息请参考附录31 项融合基因筛查标准操作流程SOP on Fusion Genes of Leukemia检测信息中文 31 项融合基因筛查标准操作程序项目名称英文 SOP on Fusion Genes of Leukemia检测方法 多重 PCR 反应1. 原理及应用本检测项目利用商品化试剂盒，采用多重 PCR 方法筛查白血病常见的 31 种融合基因，可以准确、快速而且可靠地确定白血病的分子类型，提供白血病诊断和治疗的依据。
2. 样本要求标准类型 EDTA 抗凝骨髓/ 全血 2ml收集容器 EDTA 抗凝管（不含其它物质）运输容器 带塑胶盖试管运输要求 0-10˚C冷藏运输小于 2 天室温 短暂冷藏温度（2-8˚C）3 天-20C 三个月（提取出 RNA）稳定性及储藏要求-70C 一年（提取出 RNA cDNA）时间要求 无样本拒收及采取措施 拒绝重度溶血、严重凝血样本、肝素抗凝影响／干扰因素溶血、凝血、脂血、骨髓间质较多或肝素抗凝标本可能会严重影响实验结果其它条件 应避免反复冻融标本ADICON Clinical Laboratories, Inc.艾迪康医学检验中心Standard Operating Procedure标准操作程序 AD No.编号: SOP-ET219 Version版本:10 Page页码 2 of 53. 试剂3.1 订购试剂及试剂盒试剂名称厂家 货号 试剂型号及规格储藏及稳定性 准备工作逆转录试剂盒TOYOBO逆转录酶-20 ℃保存；其他 4℃保存逆转录酶 4℃备用，其他室温平衡 15 分钟KOD PCR 试剂盒TOYOBO酶-20℃ 保存；其他 4℃保存酶 4℃备用；其他室温平衡15 分钟Thunerbird probe QPCR mixTOYOBO -20℃保存； 室温平衡 30分钟TAKARA RTAQ PCR 试剂盒TAKARA酶-20℃ 保存；其他 4℃保存酶 4℃备用；其他室温平衡15 分钟Dutp上海生工2mM， 4℃保存室温平衡 15分钟UNG 酶 上海闪晶 -20℃保存； 4℃备用Trizol Reagent invitrigen 200ml/瓶 4℃保存 4℃备用100 bp DNA ladderTAKARA4℃保存 4℃备用GELred 核酸染料 万飞生物 RT RT3.2 自备试剂红细胞裂解液；PBS（？）氯仿，异丙醇，75%乙醇，无水乙醇， RNase-free 水3.3 引物配置3.3.1 储存浓度引物（100umol/L）的配制ADICON Clinical Laboratories, Inc.艾迪康医学检验中心Standard Operating Procedure标准操作程序 AD No.编号: SOP-ET219 Version版本:1。
0 Page页码 3 of 5将Takara订购的32条特异性逆转录引物及多重PCR内外侧引物12000rpm/分钟离心1分钟，超净台静默状态下操作，跟据说明书给出的质量nmol数*10ul加入DEPC-H2O，混匀离心，-20℃保存3.3.2 工作浓度引物的配制3.3.2.1 32条特异性逆转录引物将储存浓度的32条特异性逆转录引物各取5ul ，等量混合，混匀，6000rpm/分钟离心15s ，分装，-20 ℃保存3.3.2.2 多重PCR初筛引物按照《31种融合基因分组表》将融合基因引物分成8组，每组共2管，分内外侧每管按表中的引物序列号加入储存浓度的多重PCR 引物各3ul，内参引物各1.5ul，补水到50ul，工作浓度为6umol/L，混匀离心，分装20℃保存外侧初筛引物配制表组别 筛查引物编号 内参引物编号 加水量S1 111，121，131，141，151，161，171，181011，021 23ulS2 141，151，231，241，251，261，271，281011，021 23ulS3 311，011，321，331，341，351，361 021 27.5ulS4 411，421，431，441，461，471 011，021 29ulS5 141，151，531，541，551，561，571 011，021 26ulS6 631，641，651 011，021 38ulS7 711，721，731，741，751 011，021 32ulS8 811，841，851，861，871 011，021 32ul内侧初筛引物配制表组别 筛查引物编号 内参引物编号 加水量S1 112，122，132，142，152，162，172，182012，022 23ulS2 142，152，232，242，252，262，272，282012，022 23ulS3 312，012，322，332，342，352，362 022 27.5ulADICON Clinical Laboratories, Inc.艾迪康医学检验中心Standard Operating Procedure标准操作程序 AD No.编号: SOP-ET219 Version版本:1。
0 Page页码 4 of 5S4 412，422，432，442，462，472 012，022 29ulS5 142，152，532，542，552，562，572 012，022 26ulS6 632，642，652 012，022 38ulS7 712，722，732，742，752 012，022 32ulS8 812，842，852，862，872 012，022 32ul.3.3.2.3 多重PCR分离引物按照《31种融合基因分组表》将融合基因引物分成32组，每组2管，分内外侧将每一组中储存浓度的融合基因PCR引物各5ul，补水至50ul，工作浓度为10umol/L混匀离心，分装20 ℃保存常规分离实验时，4A、6A、6B、8B 、8C共5管融合基因不进行分离备注出处)3.3.2.4 荧光定量引物探针混合物的配制将储存浓度的融合基因的引物及探针先配制成工作浓度10umol/L ，将每一个融合基因的所有引物和探针按2：1的比例进行混合，备用4. 仪器设备名称 型号 确认方式普通低速离心机 Anke TDLSO-2B 自检漩涡震荡仪 VWR 分钟 ivortexer 自检高速冷冻离心机 Sigma 3K15 自检生物安全柜 Biobase 自检使用的仪器设备普通 PCR 仪 BIOER 自检荧光定量 PCR 仪 ABI 7300 自检5. 质量控制5.1cDNA 质量的质控用荧光 PCR 定量的方法检查样本内参基因 ABL，若 ABL≥1.00E+03，样本质量合格；若 ABL1000copiers，融合基因 CT 值<35，结果报告 ABL 拷贝数及发现 XX 融合基因。
7.1.2 样本内参 ABL<1000copiers，则将 RNA 等倍稀释后重新逆转录，还是如此可报告 RNA 质量差，内参偏低7.2 多重 PCR 初筛检测结果分析7.2.1 样本电泳图谱中在 671bp 位置可见内参条带 E2A，大多数样本 S4，S7 组分别可见212bp，287bp 的阳性条带7.2.2 根据《多重 PCR 融合基因分组及产物长度分析表 》和样本的临床诊断分析阳性条带，进行分离试验7.2.3 若内参 E2A 条带未出，同时又无其他阳性条带，需分析该样本是否失控，结合荧光定量PCR ABL 拷贝数，决定是否二次逆转录7.2.4 阳性及阴性电泳图谱示例 （图中标记）ADICON Clinical Laboratories, Inc.艾迪康医学检验中心Standard Operating Procedure标准操作程序 AD No.编号: SOP-ET219 Version版本:10 Page页码 11 of 5S5 阳性，进行分离实验 阴性结果，S4、S7 有条带7.3 多重 PCR 分离检测结果分析7.3.1 阳性对照有条带，阴性对照及空白对照无条带。
7.3.2 阳性条带清晰明确，根据 《 多重 PCR 融合基因分组及产物长度分析表 》 和样本的临床诊断分析阳性条带，片段大小及融合基因类型是否符合，同时参考流式及染色体结果，若都符合则报告：检测到 XX 融合基因7.3.3 阴性结果明确，报告：未检测到常见的 31 种融合基因7.3.4 有条带但很弱，或片段大小不符，阴性、阳性、空白对照正常，可直接报：未检测到常见的31 种融合基因7.3.5 有阳性条带，但阴性也有条带，需就该融合基因进行单拉实验,进一步分析，是否存在污染7.3.6 若所有条带皆无，需分析原因，重新检测7.3.7 若一样本同一大组中所有融合基因都有条带，非特异性扩增，需重新检测8. 复查标准8.1 电泳结果条带个别有缺失的标本需就缺失的部分复查，以确认检测结果的准确性8.2 检测结果与临床不符，或检测结果自相矛盾，需重新检测8.3 7.3 中提到的需要重新检测的情况参见 《 实验室检验结果复查的标准操作程序 》9. 结果报告 参见 《 SOP-ET003 特检实验室报告审核标准操作程 》10. 取消检测标准（改为“退检标准”是不是更合适？）10.1 样本严重凝血，溶血，无法提取白细胞10.2 标本类型不符ADICON Clinical Laboratories, Inc.艾迪康医学检验中心Standard Operating Procedure标准操作程序 AD No.编号: SOP-ET219 Version版本:1。
0 Page页码 12 of 510.3 荧光定量 PCR 检测内参 ABL<1000copiers，同时多重 PCR 初筛实验无任何条带，重复后结果一致11. 方法限制干扰物质，严重溶血，肝素抗凝，反复冻融，灵敏度和特异性（低还是什么影响，能否具体说明怎么影响？）12. 安全须知SOP-LAB010-G《实验室消毒标准操作程序》 SU0004-G《检验工作人员安全防护制度》SU0006-G《意外事故处理制度》13. 相关文件SOP-ET003 特检实验室报告审核标准操作程实验室检验结果复查的标准操作程序多重 PCR 融合基因分组及产物长度分析表31 种融合基因分组表17.相关记录《RNA 加水量及浓度记录表》《31 项融合基因筛查初筛实验情况记录表》《31 项融合基因筛查分离实验情况记录表》。