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1、细胞增殖及细胞活力检测方法目前主要有两种用于检测细胞增殖能力的方法。一种是直接的方法，通过直接测定进行分裂的细胞数来评价细胞的增殖能力。另一种是间接的方法，即细胞活力（cell viability）检测方法，通过检测样品中健康细胞的数目来评价细胞的增殖能力。显然，细胞活力检测法并不能最终证明检测样品中的细胞是否在增殖。如细胞在某一培养条件下会自发启动凋亡程序，但药物的干扰可抑制凋亡的发生；这时若采用细胞活力检测法，显然可以区分两种条件下的细胞数量，但我们并不能从药物干扰组细胞数大于对照组的事实说明药物可促进细胞增殖的结论。所以最直接的证据应该采用方法一。用于检测细胞增殖能力最经典的方法是用氚标
2、记的胸腺嘧啶核苷处理细胞，再检测 DNA链中氚含量。若细胞具有增殖能力，DNA 合成过程中将会采用氚标记的胸腺嘧啶核苷作为合成原料，因此检测细胞 DNA 链内标记核苷酸的量可判断细胞是否进行 DNA 的合成。但更为常用的方法是 BrdU 检测法。用 BrdU 预处理的细胞中， BrdU 可代替胸腺嘧啶核苷插入复制的 DNA 双链中，而且这种置换可以稳定存在，并带到子代细胞中。细胞经过固定和变性处理后，可用免疫学方法检测 DNA 中 BrdU 的含量（如采用鼠抗 BrdU 单克隆抗体特异识别 BrdU,再采用辣根过氧化酶标记的山羊抗鼠 IgG 二抗标记，最后用比色法或荧光的方法进行定量测定） ，
3、从而判断细胞的增殖能力。Calbiochem/EMD 公司提供一种 BrdU 检测试剂盒，以微孔板的形式，合并所有清洗、固定、变性的步骤以单一试剂当中。比色检测在一抗二抗标记后在450nm 下读数，所有操作在3小时内结束。而且该试剂盒的灵敏度与市场上其他同类产品相比是最强的。1000个细胞以上水平的检测只需用 BrdU 预孵育 2小时，100个细胞则采用过夜预孵育，即可检测细胞的增殖能力。BrdU 法的一个缺点是需要固定和变性等破坏 DNA 的处理。有些情况下，研究者可能希望在测定细胞增殖能力的同时检测细胞的总 DNA 含量，然而，在变性条件下，DNA 的双链结构将被破坏，DAPI 和 Hoe
4、chest 33342等核酸标记探针就不再能识别 DNA，因而也无法估计 DNA 总量。Molecular Probes 公司的 Click-iT EdU 检测试剂盒可以解决这个问题。这种方法不需要变性步骤，因为荧光探针标记的叠氮化物小分子，而不是庞大的抗体分子，可以很轻易的识别并结合未变性 DNA 双链中的 EdU 分子。采用 BrdU 方法时，你必须非常小心的去对 DNA 进行变性，才能一方面使 BrdU 抗体进入细胞，另一方面又保留足够的双链 DNA 分子来进行细胞周期的分析。有了 EdU 后则不同，由于你不再需要变性，这一切都很简单了；另外，常常用于 DNA 变性的 HCl，可能破细胞
5、内坏蛋白的抗原识别位点，因而限制了 BrdU 检测法中同时检测其他蛋白的应用，但这种情况在 EdU 法中不存在。 图1：EdU 及 BrdU 原理示意图（摘至 invitrogen 说明书）在一些情况下，细胞活力的检测相当于细胞增殖能力的测定。用于细胞活力检测的方法又很多，这些方法主要采用特殊的试剂来测定细胞的代谢活力，Alamar Blue，MTT 及其他四唑盐。它们通过检测细胞的氧化还原活性来检测细胞增殖能力，所以这是一种间接的方法。Calbiochem 的快速细胞增殖试剂盒，或者，严格来说，叫细胞活力试剂盒，采用一种四唑盐试剂 WST-1来对细胞活力进行快速的检测。线粒体剪切 WST1试
6、剂，产生一种水溶性的 formazan 盐，所以这是一种相对可靠的测定健康细胞活力的方法。一种类似的但更为灵敏的方法是 Calbiochem 公司的超敏细胞增殖试剂盒，采用 calcein-AM（一种荧光探针）来标记细胞。这种增加的灵敏度来自于额外的检测步骤，即采用 PBS 替代培养基或血清来减小背景。Invitrogen 公司还提供了一种采用荧光素酶检测细胞内 ATP 水平的方法。健康细胞中荧光素激发出的光可以很容易读出，并且具有非常小的背景。无荧光信号表明细胞线粒体不在产生 ATP。因此，这些方法当然也可用于细胞毒性检测实验。自由基（Free Radical, FR）是含有孤电子的原子或原
7、子团，活性氧（ Reactive Oxygen Species, ROS）是指化学性质活跃的含氧原子或原子团，包括超氧阴离子自由基、过氧化氢（H2O2） 、单线态氧、羟自由基（HO） 、烷过氧化自由基、脂过氧化自由基等。FR 和 ROS 在细胞内可通过酶反应和非酶反应产生。其中线粒体是细胞内 FR 和 ROS产生的主要来源，约占细胞内 FR 和 ROS 总量的 98%左右1，由于线粒体内超氧化物歧化酶(SOD)浓度较高，大部分 O2-歧化为 H2O2，后者可穿过线粒体膜进入胞浆。细胞内膜系统如滑面内质网及过氧化物酶体里含有一些酶, 如细胞色素 p-450 和 b3 家族、乙醇酸氧化酶、D- 氨
8、基酸氧化酶、尿酸氧化酶等，这些酶对脂溶性药物、不饱和脂肪酸、抗生素及其它代谢产物的氧化，亦可产生 H2O2 和 O2-等2，3 。除此以外，一些可溶性氧化酶、吞噬细胞 NADP 氧化酶、磷脂酶 A2(PLA2)等催化的反应，以及某些小分子的自氧化均是内源性 ROS 产生的重要来源 1，配体反应也可介导产生 FR 和 ROS4。 衰老的自由基学说认为，随着细胞复制衰老或生物整体衰老，FR 和 ROS 在衰老的细胞和组织内累积，损伤生物大分子如蛋白质、脂类、核酸等，造成其结构改变和功能丧失，甚至引起基因突变、DNA 复制停止等，最终引起复制衰老和整体衰老，FR 和 ROS 经由哪些途径引起衰老的呢
9、？1FR 和 ROS 可改变细胞的氧化还原状态。细胞内的氧化还原状态主要由谷胱甘肽 (GSH)和硫氧还蛋白(TRX)两对缓冲对进行调节，FR 和 ROS 可氧化 GSH 和 TRX，改变细胞内相对稳定的氧化还原状态，进而影响信号传导5。2FR 和 ROS 通过氧化蛋白质侧链上关键的氨基酸残基，如丝氨酸的羟基和半胱氨酸巯基，进而改变蛋白质的结构、影响蛋白质多聚化、蛋白质与 Fe-S 或其它金属离子的结合等。如被氧化修饰的-OH 或-SH 位于酶的催化中心，则酶的催化活性丧失；如被氧化修饰的氨基酸残基位于 DNA 结合域，则转录因子失去了与 DNA 结合及调控转录的能力；而蛋白质若不能与 Fe-S
10、 结合，则呼吸链电子传递及氧化磷酸化受阻。另外，损伤的蛋白质半寿期延长，而衰老的细胞中蛋白质合成速率下降，导致受损伤的蛋白质更新率下降6。3 FR 和 ROS 可氧化 DNA，使其断裂或突变，DNA 复制和转录受阻7，8 。如果 FR和 ROS 导致的 DNA 单链断裂发生于染色体端区末端，则端区缩短加快。在正常培养条件下，人二倍体成纤维细胞的端区缩短速率主要取决于细胞内的氧化压力9。4 FR 和 ROS 加速了细胞内非酶糖基化反应，以及大分子如蛋白质之间的交联 10。5 FR 和 ROS 损伤端区，可能引发了衰老相关基因如 p16 和 p21 的过表达。 MTT 法测定细胞相对数和相对活力一
11、、原理噻唑兰，简称 MTT，可透过细胞膜进入细胞内，活细胞线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性 MTT 还原为难溶于水的蓝紫色的 Formazan 结晶并沉积在细胞中，结晶物能被二甲基亚砜（DMSO）溶解，用酶联免疫检测仪在 490nm 波长处测定其光吸收值，可间接反映细胞数量。细胞活性测定方法有台盼蓝染色法、克隆（集落）形成法、3H 放射性同位素掺入法、MTT法等。其中 MTT 法以其快速简便，不需要特殊检测仪器、无放射性同位素、适合大批量检测的特点而得到广泛的应用。但 MTT 法形成的 Formazan 为水不溶性的，需要加有机溶剂溶解，由于在去上清操作时会有可能带走小部分的 Formazan，
12、故有时重复性略差。为了解决这个问题，研究人员又开发了很多种水溶性的四氮唑盐类：如 XTT、CCK-8 （WST-8 ）等。现就这三种四氮唑盐类方法作一个简单介绍：1.MTT 法MTT：化学名： 3-(4，5-二甲基噻唑 -2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性 MTT 还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲 （Formazan ）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲 ，用酶联免疫检测仪在490nm 波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于
13、一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。缺点：由于 MTT 经还原所产生的甲 产物不溶于水，需被溶解后才能检测。这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲 的有机溶剂对实验者也有损害。2.XTT 法XTT：化学名： 2,3- bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-(phenylamino)carbonyl-2H-tetrazolium hydroxide，作为线粒体脱氢酶的作用底物，被活细胞还原成水溶性的橙黄色甲 产物。当 XTT 与电子偶合剂（例如 PMS）
14、联合应用时，其所产生的水溶性的甲 产物的吸光度与活细胞的数量成正比。优点：1、使用方便，省去了洗涤细胞；2、检测快速；3、灵敏度高，甚至可以测定较低细胞密度；4、重复性优于 MTT。缺点：XTT 水溶液不稳定，需要低温保存或现配现用。3.CCK-8法或称 WST-8法CCK-8试剂中含有 WST8：化学名：2-(2-甲氧基-4- 硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4- 二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐，它在电子载体1-甲氧基-5- 甲基吩嗪 硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲 产物（Formazan） 。生成的甲 物的数量与
15、活细胞的数量成正比。用酶联免疫检测仪在450nm 波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。该方法已被广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞增殖试验、细胞毒性试验以及药敏试验等。优点：1、使用方便，省去了洗涤细胞，不需要放射性同位素和有机溶剂；2、检测快速；3、灵敏度高，甚至可以测定较低细胞密度；4、重复性优于 MTT；5、对细胞毒性小；6、为1瓶溶液，毋需预制，即开即用。缺点:1、与 MTT 相比，CCK-8和 XTT 的价格比较贵。2、CCK-8试剂的颜色为淡红色，与含酚红的培养基颜色接近，不注意的话容易产生漏加或多加。三种方法的比较MTT 法 XTT 法 CC
16、K-8法（WST-8法）甲 物水溶性 难溶性 水溶性 水溶性检测波长 490 nm 450nm 450nm性状 粉末 2瓶溶液 1瓶溶液使用方法 配成溶液后使用 现配现用 毋需预制使用有机溶剂 DMSO 或其它溶剂 方便性 + + +检测速度 + + +重复性 + + +稳定性 + + +工作量 - - -对细胞毒性 - - -对人体毒性 - - -一、简介流式细胞仪（一）流式细胞仪概念流式细胞术（Flow Cytometry ，FCM）是一种对处在液流中的细胞或其它生物微粒（如细菌）逐个进行多参数的快速定量分析和分选的技术。简言之，流式细胞仪是测量染色细胞标记物荧光强度的细胞分析仪，是在单个细胞分析和分选基础上发展起来的对细胞的物理或化学性质，如大小、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等进行快速测量并可分类收集的高技术，FCM 以其快速、灵活、大量、灵敏和定量的特色，广泛应用于基础研究和临床
