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1、离子交换层析法 （Ion exchange chromatography）1. 1 基本原理：包括离子交换法的原理和步骤。1. 2. 树脂材质：介绍常用的阴阳离子交换树脂成份。2. 3. 离子交换剂的选择：如何选用适当的阴（阳）离子交换剂和缓冲液。3. 4. 离子交换树脂的前处理：使用树脂前的注意事项和处理方法。一、基本原理离子交换层析法 （ion exchange chromatography，简称 IEC）是从复杂的混合物中，分离性质相似大分子的方法之一，依据的原理是物质的酸碱性、极性，也就是所带阴阳离子的不同。电荷不同的物质，对管柱上的离子交换剂有不同的亲和力，改变冲洗液的离子强度和 p
2、H 值，物质就能依次从层析柱中分离出来。离子交换层析法大致分为 5 个步骤：1. 1. 离子扩散到树脂表面。2. 2. 离子通过树脂扩散到交换位置。3. 3. 在交换位置进行离子交换；被交换的分子所带电荷愈多，它与树脂的结合愈紧密，也就愈不容易被其它离子取代。4. 4. 被交换的离子扩散到树脂表面。5. 5. 冲洗液通过，被交换的离子扩散到外部溶液中。离子交换树脂的交换反应是可逆的，遵循化学平衡的规律，定量的混合物通过管柱时，离子不断被交换，浓度逐渐降低，几乎全部都能被吸附在树脂上；在冲洗的过程中，由于连续添加新的交换溶液，所以会朝正反应方向移动，因而可以把树脂上的离子冲洗下来。如果被纯化的物
3、质是氨基酸类的分子，则分子上的净电荷取决于氨基酸的等电点和溶液的 pH 值，所以当溶液的 pH 值较低，氨基酸分子带正电荷，它将结合到强酸性的阳离子交换树脂上；随着通过的缓冲液 pH 逐渐增加，氨基酸将逐渐失去正电荷，结合力减弱，最后被洗下来。由于不同的氨基酸等电点不同，这些氨基酸将依次被洗出，最先被洗出的是酸性氨基酸，如 apartic acid 和 glutamic acid（在约 pH34 时），随后是中性氨基酸，如glycine 和 alanine。碱性氨基酸如 arginine 和 lysine 在 pH 值很高的缓冲液中仍带有正电荷，因此这些在约 pH 值高达 1011 时才出现。
4、二、树脂材质 最常见的离子交换树脂材质是聚苯乙烯-苯二乙烯（polystyrenedivinylbenzene），它是由苯乙烯（styrene）和苯二乙烯（divinylbenzene ）聚合产生的三维网状结构，举例来说，Dow 化学公司所生产的树脂 Dowex 508，表示含 8%苯二乙烯。根据交换树脂的性能，分为阳离子与阴离子交换树脂。1. 阳离子交换树脂分为强酸型、中强酸型和弱酸型三类，强酸型树脂含有R SO 3H，中强酸型树脂含有PO 3H2、PO 2H2 或OPO 2H2，弱酸型树脂含有COOH 或OH。阳离子交换树脂进行的反应如下图一：图一 图二2. 阴离子交换树脂分为强碱型、中强
5、碱型和弱碱型三类，含有铵盐，四级铵盐 N +(CH3)3 为强碱型树脂，三级以下铵盐 N(CH 3)2、 NHCH 3、 NH 2 都属弱碱型树脂；同时具有强碱和弱碱型基团的，为中强碱型的树脂。阴离子交换树脂进行的反应如图二：除了树脂以外，纤维素（cellulose）、葡聚糖凝胶（Sephadex gel）和琼脂糖凝胶（Sepharose）也是常用的离子交换材质，特性是具有亲水性和较大的表面积，对生物活性物质而言，是一个较为温和的环境，同时也是大分子所适用的分离纯化材质 。常用的种类如图三：图三实验证明，纤维材质对蛋白质和核酸的分离纯化效果相当好，因为离子交换纤维的种类多，能依据不同分离目的使
6、用，且功能团基主要在表面，对生物大分子的交换十分有利。三、离子交换剂的选择离子交换剂的选择，首重保持欲分离物质的生物活性，以及在不同 pH 值环境中，此物质所带的电荷和电性强弱。1. 阴阳离子交换剂的选择若被分离物质带正电荷，例如 polymyxin、 cytochrome C 这些碱性蛋白质，它们在酸性溶液中较稳定，亲和力强，故采用阳离子交换剂；其它像 heparin、nucleic acid 这类酸性物质，在碱性溶液中较稳定，则使用阴离子交换剂；如果欲分离的物质是两性离子，一般考虑在它稳定的 pH 范围带有何种电荷，作为交换剂的选择。以胰岛素（insulin ）为例，它的等电点为 pH 5
7、.3，因此在 pH5.3 的碱性溶液中，使用阴离子交换剂。简言之，已知等电点的物质，在高于等电点的 pH 条件下，因带有负电荷，应采用阴离子交换，在低于等电点的 pH 下，则采用阳离子交换。未知等电点的物质，在一定 pH 条件下进行电泳，向阳极移动较快的物质，在同样条件下可被阴离子交换剂吸附，向阴极移动较快的物质可被阳离子交换剂吸附。1. 2. 缓冲液的选择缓冲液酸碱度的选择，决定于被分离物质的等电点、稳定性、溶解度和交换剂离子的pK 值。使用阴离子交换纤维时要选用低于 pK 值的缓冲液，若欲分离的物质属于酸性，则缓冲液的 pH 值要高于该物的等电点；用阳离子交换纤维时要选用高于 pK 值的缓
8、冲液，目的物属于碱性物质的话，缓冲液要低于该物等电点的 pH 值。缓冲液离子以不干扰分离物活性测定、不影响待测物溶解度、不发生沉淀为原则，如使用 UV 吸收法测样品，那么 pyridine 或 barbital 这类会吸收 UV 的物质就不适用。 四、离子交换树脂的前处理离子交换树脂使用前，先以蒸馏水除去其内之杂质 ，并以 NaOH 和 HCl 处理树脂，使其上的官能基完全露出。阴离子交换树脂先以 15 倍于树脂量的 0.5 N HCl 浸泡 30120分钟，再以水清洗至 pH 7.0，之后用 0.5 N NaOH 浸泡 30120 分钟，同样以水清洗至 pH 7.0，最后用欲使用的缓冲液浸泡
9、。阳离子交换树脂用 15 倍于树脂量的 0.5 N NaOH 浸泡30120 分钟，以水清洗至 pH 7.0，之后用 0.5 N HCl 浸泡 30120 分钟，再以水清洗至 pH 7.0，最后用欲使用的缓冲液浸泡。详细操作方法离 子 交 换 树 脂 的 使 用 说 明一、贮存与运输离子交换树脂一般是在充分膨胀、湿润的球粒状态下供应，在贮存、运输过程中要保持包装完好无损，避免树脂脱水、冻裂及污染。不能露天存放，存放处的温度为 040，当存放处温度稍低于 0时，应向包装内加入澄清的饱和食盐水，浸泡树脂。此外，当存放处温度过高时，不但使树脂易于脱水，还会加速阴树脂的降解。一旦树脂失水，使用时不能直
10、接加水，可用澄清的饱和食盐水浸泡，然后再逐步加水稀释，洗去盐分，贮存期间应使其保持湿润。二、脱水树脂复苏树脂干燥失水是最大危险之一，失水树脂用 10%食盐水浸泡 12 小时，然后稀释，再投入使用，以防止树脂水合急剧膨胀而破损。三、树脂鉴别使用单位存放树脂和填装时发生混淆，必须鉴别，确认后，投入装置，以充分发挥树脂的工作性能。1、鉴别 0017 和 2017 两种树脂，可以利用湿真密度不同而区别，取一点树脂放入饱和食盐盐水中，浮在上面的是 2017 阴树脂，下沉的则是 0017 阳树脂。2、鉴别强弱型阳树脂，一是外观，强酸性阳树脂为棕黄色，弱酸性阳树脂为乳白色或淡黄色，二是用转型膨胀率判断，阳树
11、脂用盐酸转为 H 型，再用烧碱转为 Na 型，是其体积膨胀，弱酸性树脂明显大于强酸性树脂。3、鉴别强弱型阴树脂，可以利用加酚酞的氢氧化钠浸泡 10min，用无离子水洗净后，强型阴树脂呈紫色，大孔强型阴树脂呈粉红色，弱型阴树脂不变色。四、树脂预处理将准备装柱使用的新树脂，先用热水（清洁的自来水也可）反复清洗，阳离子交换树脂可用 7080的热水，阴离子交换树脂的而热性能较差一些，可用 5060热水。开始浸洗时，每隔 15 分钟换水一次，浸洗时要不时搅动，换水 45 次后，可隔约 30 分钟换水一次，总共换水 78 次，浸洗至浸洗水不带褐色，泡沫很少时为止。水洗后，再经酸碱处理，阳离子交换树脂可按下
12、述步骤处理：1、用 1N 盐酸缓慢流过树脂，用量约为强酸阳树脂体积的 23 倍，弱酸阳树脂体积的 35 倍，每小时 1.5 倍床层体积流过。（一般用 1.52.0 mol/L HCl, 质量分数约为46%, 1.52BV 是指酸用量（床层体积的倍数） 。配制方法：1ml 浓盐酸稀释至 8ml,此时其浓度为 4.5%，1.5mol/L）2、用水冲洗，出水 PH 为 5 左右，用 3 倍树脂体积 5%的 NaCl 溶液流过树脂，流速与1 相同。3、用 1NNaOH 流过树脂，用量及流速与 1 相同。4、用水冲洗至出水 PH 为 9 左右。5、用 1N 盐酸或硫酸，将树脂转成 H-型，用量为树脂体积
13、的 35 倍，流速与 1 相同。6、酸流完后，用去离子水冲洗至出水 PH 值为 6 以上时，即可投入使用。对于阴离子交换树脂水洗后的酸、碱处理次序，可采用碱 酸 碱次序，酸、碱用量及流速，与阳树脂相对应，弱碱阴树脂与弱酸阳树脂相对应。五、离子交换树脂的复活处理1、铁污染：树脂被铁污染后，颜色变深甚至发黑，可以用二倍树脂体积 10%的盐酸，以约 0.6m/h 流速通过树脂层，然后用同样流速 40的清水清洗，最后用过量的 NaOH 再生（阳树脂）。2、硅污染：被树脂吸附的硅酸，在低 PH 的条件下，容易聚合为高聚物沉淀于树脂中，可用 4050，6%8%NaOH 溶液浸泡，再用清水洗，为避免硅污染，应适当提高再生剂的浓度和温度。3、有机物污染：阴树脂很容易被水中的有机物污染，使树脂变色发黑，水的电导上升，PH 值下降，功效降低，这样可用 10 倍树脂体积，温度为 40的 8%的 NaCl 和 4%的NaOH 混合液，以 0.6m/h 的流速通过树脂层，或采用浸泡 24h，可获得较好的复苏效果。
