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1、课题2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数,一、课题背景,1.尿素的利用,尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。,2.常见的分解尿素的微生物,芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌也能分解尿素。,该去哪里取样?,该配置怎样的培养基?,2、方法：造成有利于目的菌株生长的环境同时抑制大多数其他类型微生物,阅读P21 筛选菌株,1、土壤中取样。怎样分离能分解尿素的细菌？,从物理性质看此培养基属于哪类？,固体培养基,在此培养基中哪些作为碳源、氮源？,碳源：葡萄糖、尿素氮源：尿素,此配方培养基为什么能够筛选
2、出产生脲酶的细菌?,氮源是尿素，只允许能以尿素作为氮源的微生物生长。,1.利用尿素作为唯一氮源的培养基分离出的微生物只是一种细菌吗？都是能分解尿素的微生物吗？,2.请你提供一种方法，判断分解尿素的细菌确实能将尿素分解成氨。,4.怎样证明此培养基具有选择性呢？,在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂（P26）,以尿素为唯一氮源的培养基,牛肉膏蛋白胨培养基,是,分离尿素细菌,判断该培养基有无选择性,只生长尿素细菌,生长多种微生物（菌落数明显多于实验组）,是,如何统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌？,计数法,显微镜直接计数法稀释涂布平板法比浊法膜过滤法,1.显微镜直接计数法：这种方法是利用
3、特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。此法的缺点是不能区分死菌和活菌。,每毫升原液所含细菌数每小格平均细菌数40010000稀释倍数,2.间接计数法（活菌计数法）原理：在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的，即一个菌落代表原先的一个单细胞。常用方法：稀释涂布平板法。,每克样品中的菌落数(CV)M其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，M代表稀释倍数。,某同学在稀释倍数为106 的培养基中测得平板上菌落数的平均数为234，那么每克样品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液的
4、体积为0.1ml） ( )A. 2.34108B. 2.34109C. 234D. 23.4,B,稀释涂布平板注意事项为了保证结果准确，一般选择菌落数在30300的平板上进行计数。为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个或三个以上的培养皿中，经涂布，培养计算出菌落平均数。统计的菌落往往比活菌的实际数目低。,关键：恰当的稀释度,如果106稀释度下的三个重复组菌落数分别为1个、50个、170个。应如何处理这个稀释组的数据？,如果得到了2个或2个以上菌落数目在30300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确，需要重新实验。,在
5、菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。,此记录是否完整？,P22统计菌落数,A同学从对应的106倍稀释的培养基中筛选出大约150个菌落，但是其他同学在同样的稀释度下只选择出大约50个菌落。分析其原因。,原因：土样不同，培养基污染或操作失误(或者是混入了其他的含氮物质),如何证明A同学制作的培养基确实被污染了？,如何证明A同学操作有问题？,方案一：由其他同学用与A同学相同土样进行实验,方案二：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。,结果预测：如果结果与A同学一致，则证明
6、A无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。,实验设计,一土壤取样,取土样用的小铁铲和盛土样的的信封灭菌。,准备牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基。每个稀释度下需要3个选择培养基，1个牛肉膏蛋白胨培养基。还需要8个灭菌试管和1个灭菌移液管 。 稀释相同倍数的菌液，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目，因此，牛肉膏蛋白胨培养基可以作为对照，用来判断选择培养基是否起到了选择作用。,二制备培养基,应在火焰旁称取土壤10g。在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行,分离不同的微生物采用不同的稀释度,（三）样品的稀释,（四）取样涂布,（五）微生物的培
7、养与观察,培养不同微生物往往需要不同培养温度。 细菌：3037培养12d 放线菌：2528培养57d 霉菌：2528的温度下培养34d。,某细菌固体培养基的组成成分是KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4、葡萄糖、尿素、琼脂和蒸馏水，其中凝固剂是，碳源是，氮源是。已知只有能合成脲酶的细菌才能在该培养基上生长，故该培养基属于培养基。从同化作用类型上看，用该培养基培养的细菌属于。,琼脂,葡萄糖,尿素,选择,异养型,在微生物群体生长规律的测定中，种内斗争最显著最激烈的时期是A调整期 B对数期 C稳定期 D衰亡期,答案：C,1.对细菌群体生长规律测定的正确的表述是（ ） A.在液体培养基上进行 B.
8、至少接种一种细菌 C.接种一个细菌 D.及时补充消耗的营养物质 2.使用选择培养基的目的是（ ） A.培养细菌 B.培养真菌 C.使需要的微生物大量繁殖 D.表现某微生物的特定性状与其他微生物加以区别3.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是( ) A.CO2和N2 B.葡萄糖和NH3 C.CO2和尿素 D.葡萄糖和尿素,A,C,D,4.下列说法不正确的是（ ） A.科学家从7080度热泉中分离到耐高温的TaqDNA聚合酶 B.统计某一稀释度的5个平板的菌落数依次为M1、M2、M3、M4、M5，以M3作为该样品菌落数的估计值 C.设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影
9、响，提高实验结果的可信度 D.同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，种类最多。,B,5.为培养和分离出酵母菌并淘汰杂菌，常在培养基中加入A.较多的氮源物质 B.较多的碳源物质C.青霉素类药物 D.高浓度食盐,C,常见选择培养的方法,1、在培养基中加入某种物质（1）青霉素 分离酵母菌和霉菌 (2)高浓度食盐 金黄色葡萄球菌2、改变培养基的营养成分（1）缺乏氮源 固氮微生物 （2）含无机碳源 自养微生物 (3)石油作为唯一碳源 能消除石油污染的微生物 3、改变微生物的培养条件 （1）高温 耐高温微生物 （2）无氧 厌氧型、兼性厌氧型,课题3 分解纤维素的微生物的分离,是自然界中纤维素含量最高
10、的天然产物。,1.纤维素与纤维素酶,纤维素是地球上含量最丰富的 。,多糖类物质,棉花,一 基础知识,纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即C1酶、 CX酶和葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。,纤维素,纤维二糖,葡萄糖,C1酶Cx酶,葡萄糖苷酶,2.纤维素分解菌的筛选, 筛选纤维素分解菌的方法是_。该方法可以通过_反应直接筛选。,刚果红染色法,颜色,其原理是：刚果红可以与纤维素形成_，当纤维素被 _分解后，红色复合物 无法形成，出现以_为中心的_，我们可以通过_来筛选纤维素分解菌。,红色复合物,纤维素酶,纤维素分解菌,透明圈,是否产生透明圈
11、,刚果红能与哪项物质形成红色复合物A纤维二糖 B纤维素 C葡萄糖 D麦芽糖,1.下列关于纤维素酶的说法，错误的是,A.纤维素酶是一种复合酶，至少包括三种B.纤维素酶可把纤维素分解成葡萄糖C.纤维素酶可用于去掉植物的细胞壁D.葡萄糖苷酶可把纤维素分解成葡萄糖,2.利用刚果红法可以筛选出纤维素分解菌，下列说法错误的是,A.刚果红能与纤维素形成红色复合物 B.刚果红能与纤维二糖形成红色复合物 C.刚果红不能与葡萄糖形成红色复合物D.若培养基上产生了透明圈，则说明已筛选出了纤维素分解菌,土壤取样,选择培养,梯度稀释,将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上,挑选产生透明圈的菌落,本实验流程与尿素分解菌的
12、分离实验流程有哪些异同？,选择培养,1.选择培养的目的：,增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从样品中分离到所需要的微生物,2.制备选择培养基,参照课本29页旁栏,a.旁栏中的配方是液体培养基还是固体培养基？为什么？,b.这个培养基对微生物是否具有选择作用？如果具有，是如何进行选择的？,c.你能否设计一个对照实验，说明选择培养基的作用,用牛肉膏蛋白胨培养基与之对照,选择培养时应将锥形瓶固定在A桌子上 B温箱里 C窗台上 D摇床,二、实验操作,土壤取样,选择培养,梯度稀释,将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上,挑选产生透明圈的菌落,按照课题1的稀释操作方法，将选择培养后的培养基进行等比稀释，稀释
13、最大倍数到106,参照课本刚果红染色法，挑选产生透明圈的菌落，一般即为分解纤维素的菌落,使用刚果红染色法时，加入刚果红的时机是：制备培养基时 梯度稀释时 倒平板时 涂布时 培养基上长出菌落时 A B C D,C,练一练,1.在富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌，符合下列哪一生物学观点？A.生物结构与功能相适应的观点 B.生物结构与功能整体性观点C.生物与环境相适应的观点 D.生物发展进化的观点,C,2.从土壤中分离获得某种微生物的步骤是 土壤取样 梯度稀释 选择培养 菌悬液涂布平板 挑选出单个菌落A. B.C. D.,B,3.有关选择培养正确的叙述是,A.可以增加纤维素分解菌的浓度B.可以减少
14、纤维素分解菌的浓度C.所用培养基是固体培养基D.所用培养基是平板培养基,A,【练一练】 有些微生物能合成纤维素酶，通过对这些微生物的研究和作用，使人们能够利用秸秆等废弃物生产酒精，用纤维素酶处理服装面料等。研究人员用化合物A、硝酸盐、磷酸盐以及微量元素配制的培养基，成功的筛选到能产生纤维素酶的微生物。分析回答问题。 (1)培养基中加入的化合物A是_，为微生物的生长提供_，这种培养基属于_培养基。 (2)为了筛选出能产生纤维素酶的微生物，向培养基中加入_。,纤维素,碳源,选择,刚果红,(3)在筛选出能产生纤维素酶的微生物之前，可用液体培养基培养，增加微生物的浓度。为获得纯净的菌株，常采用平板划线的方法进行接种，此过程所用的接种工具是_，操作时采用_灭菌的方法；还可用_ 的方法接种。(4)实验结束后，使用过的培养基应该进行灭菌处理后才能倒掉，这样做的目的是_。,
