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1、液相色谱常见问题及处理方法HPLC 灵敏度不够的主要原因及解决办法1、样品量不足，解决办法为增加样品量2、样品未从柱子中流出。可根据样品的化学性质改变流动相或柱子3、样品与检测器不匹配。根据样品化学性质调整波长或改换检测器4、检测器衰减太多。调整衰减即可。5、检测器时间常数太大。解决办法为降低时间参数6、检测器池窗污染。解决办法为清洗池窗。7、检测池中有气泡。解决办法为排气。8、记录仪测压范围不当。调整电压范围即可。9、流动相流量不合适。调整流速即可。10、检测器与记录仪超出校正曲线。解决办法为检查记录仪与检测器，重作校正曲线。为什么 HPLC 柱柱压过高柱压过高是 HPLC 柱用户最常碰到的
2、问题。其原因有多方面，而且常常并不是柱子本身的问题，您可按下面步骤检查问题的起因。1、拆去保护预柱，看柱压是否还高，否则是保护柱的问题，若柱压仍高，再检查；2、把色谱柱从仪器上取下，看压力是否下降，否则是管路堵塞，需清洗，若压力下降，再检查；3、将柱子的进出口反过来接在仪器上，用 10 倍柱体积的流动相冲洗柱子， （此时不要连接检测器，以防固体颗粒进入流动池） 。这时，如果柱压仍不下降，再检查；4、更换柱子入口筛板，若柱压下降，说明您的溶剂或样品含有颗粒杂质，正是这些杂质将筛板堵塞引起压力上升。若柱压还高，请与厂商联系。 一般情况下，在进样器与保护柱之间接一个在线过滤器便可避免柱压过高的问题，
3、SGE 提供的 Rheodyne 7315 型过滤器就是解决这一问题的最佳选择。 液相色谱中峰出现拖尾或出现双峰的原因是什么？1、筛板堵塞或柱失效，解决办法是反向冲洗柱子，替换筛板或更换柱子。2、存在干扰峰，解决办法为使用较长的柱子，改换流动相或更换选择性好的柱子如何解决 HPLC 进行分析时保留时间发生漂移或急速变化漂移现象1、温度控制不好，解决方法是采用恒温装置，保持柱温恒定2、流动相发生变化，解决办法是防止流动相发生蒸发、反应等3、柱子未平衡好，需对柱子进行更长时间的平衡快速变化现象1. 流速发生变化，解决办法是重新设定流速，使之保持稳定2、泵中有气泡，可通过排气等操作将气泡赶出。3、流
4、动相不合适，解决办法为改换流动相或使流动相在控制室内进行适当混合HPLC 仪器问题1、 我的 HPLC 泵压明显的偏高，请问可能的原因？答：流速设定过高；流动相或进样中有机械杂质，造成保护柱、柱前筛板或在线过滤器阻塞；流动相粘度过大；柱温过低；缓冲盐结晶；压力传感器故障。2、 基线不稳，上下波动或漂移的原因是什么，如何解决？答：a.流动相有溶解气体；用超声波脱气 15-30 分钟或用充氦气脱气b.单向阀堵塞；取下单向阀，用超声波在纯水中超 20 分钟左右，去处堵塞物c.泵密封损坏，造成压力波动；更换泵密封d.系统存在漏液点；确定漏液位置并维修f.柱后产生气泡；流通池出液口加负压调整器g.检测器
5、没有设定在最大吸收波长处；将波长调整至最大吸收波长处h.柱平衡慢，特别是流动相发生变化时；用中等强度的溶剂进行冲洗，更改流动相时，在分析前用 10-20 倍体积的新流动相对柱子进行冲洗。3、 接头处为何经常漏液，如何处理？答：接头没有拧紧；拧松后再紧，手紧接头以手劲为限，不要使用工具，不锈钢接头先用手拧紧，再用专用扳手紧 1/4-1/2 圈，注意接头中的管路一定要通到底，否则会留下死体积。接头被污染或磨损；建议更换接头。接头不匹配，建议使用同一品牌的配件。4、 进样阀漏液是如何造成的？答：a.转子密封损坏；更换转子密封b.定量环阻塞；清洗或更换定量环c.进样口密封松动；调整松紧度d.进样针头尺
6、寸不合适，一般是过短；使用恰当的进样针（注意针头形状）e.废液管中产生虹吸；清空废液管谱图问题1、 问：造成峰拖尾的原因是什么，如何消除？答：a.筛板阻塞；反冲色谱柱、更换进口筛板b.色谱柱塌陷；填充色谱柱c.有干扰物质的存在；使用更长的色谱柱、改变流动相或更换色谱柱e.流动相 PH 值不合适；调整 PH 值，对于碱性化合物，低 PH 值更有利于得到对称峰f.样品与填料表面的溶化点发生反应；加入离子对试剂或碱性挥发性修饰剂或更改色谱柱2、 问：造成峰分叉的原因是什么，如何消除？答：保护柱或分析柱污染；取下保护柱再进行分析。如果必要更换保护柱。如果分析柱阻塞，拆下来清洗。如果问题仍然存在，可能是
7、柱子被强保留物质污染，运用适当的再生措施。如果问题仍然存在，入口可能被阻塞，更换筛板或更换色谱柱。样品溶剂不溶于流动相；改变样品溶剂，如果可能采取流动相作为样品溶剂。 3、 问：K 值增加时，拖尾更严重，这是为什么？答：反相模式，二级保留效应；a.加入三乙胺（或碱性样品）b.加入乙酸（或酸性样品）c.加入盐或缓冲剂（或离子化样品）d.更换一支柱子4、 问：保留时间的波动有几种可能的原因？答：温控不当；调节好柱温。流动相组分变化；防止流动相蒸发、反应等，做梯度时尤其要注意流动相混合的均匀。色谱柱没有平衡；在每一次运行之前给予足够的时间平衡色谱柱。液相色谱常用符号与术语表ACN 乙腈 Aceton
8、itrileAUFS 满量程的吸光度单位 Absorbance units, full scaleAs 峰不对称因子B 二元流动相中的强溶剂；例如：反相 HPLC 的甲醇 /水混合液中的甲醇BSA 牛血清白蛋白（一种蛋白质） Bovine serum albuminCAF 咖啡因（中性溶质） CaffeineCRF 色谱响应因子 Chromatographic response function；色谱图总分离度的定量指标dc 色谱柱内径（cm ）DMOA 二甲基辛胺 DimethyloctylamineDNB 2,4-二硝基甲酰（基） 2，4-Dinitrobenzoyldp 色谱柱填料的粒度
9、（cm）DRYLAB 液相资源公司（ LC Resources INC.)的计算机模拟软件。DRYLAB I 用于等度预测，DRYLAB G 用于梯度预测 F 流动相的流速（ml/min）FC-113 1，1，2-三氟-1，2，2-三氯乙烷GPC 凝胶渗透色谱法 Gel-permeation chromatographyHA 酸性溶质，能电离出 A-Hex 己烷 Hexanehr 二相邻谱带之间的谷高HVA 高香草酸 Homovanillic acidh 峰高h1,h2 相邻谱峰 1 和谱峰 2 的峰高IEC 离子交换色谱法 Ion-exchange chromatographyIP 离子对
10、Ion-pairIPC 离子对色谱法 Ion-pair chromatographyJ 色谱峰强度参数K 所给谱峰的容量因子， k=(tR-t0)/t0=tR/t0， tR=t0(1+k)k 梯度洗脱过程中，某溶质的 k的平均值或有效值kw 以水做流动相 k的外推值k1,k2 相邻谱峰 1 和谱峰 2 的容量因子L 色谱柱长度（cm ）Lc 检测器流动池光路的长度（cm ）M 溶质的分子量MC 二氯甲烷 Methylene chlorideMDST 混合设计统计技术 Mixture-design statistical technique；一种优化流动相的软件 MeOH 甲醇 Methanol
11、MTBE 甲基叔丁醚 Methyl-t-butyl etherMW 溶质的分子量N 色谱柱塔板数NAPA N-乙酰普鲁卡因胺 N-Acetylprocainamide（碱性溶质）N0 检测器的基线噪音ODS 十八烷基硅烷 OctadecylsilylP 色谱柱的压力降通常以巴（bar）表示，也用 psi；另外，也用作柱极性参数PA 普鲁卡因胺 Procainamide（碱性物质）PAH 聚芳香烃 Polyaromatic HydrocarbonPESOS 优化流动相的计算机软件（美国 Perkin-Elmer 产品）pKa 溶质酸性常数的负对数；当 pH=pKa 时，溶质中有一半是电离的Rk
12、保留值范围，Rk= （最末谱峰 k）/（最初谱峰 k）RRM 相对分离度图（通常 N=10000）Rs 相邻二谱峰的分离度S 当流动相中的%B 改变时，测量溶质保留值的变化速率的参数SAL 水杨酸 Salicylic AcidSEC 尺寸排阻色谱法 Size-exclusion chromatographyS/N 信噪比 Signal to noise ratiot 分离时间（min） （样品进样时 t=0）tp 梯度系统的滞后时间（ min）TBA 四丁基铵离子 Tetrabutylammonium ion TEA 三乙胺 TriethylamineTHF 四氢呋喃 Tetrahydrofu
13、rantk 在用于校正等度洗脱溶剂强度的流动相离开梯度混合器时，梯度洗脱的时间TLC 薄层色谱法 Thin-layer chromatographyTMA 四甲基铵 Tetramethylammonium（盐）TMS 三甲基硅烷 Trimethylsilylt0 色谱柱的死时间（min）tR 溶质的保留时间（ min）tG 梯度时间（min） ，即梯度开始至结束的时间t1,t2 相邻谱峰 1 和谱峰 2 的保留时间（min）ti 色谱图中第一峰的保留时间（min）tf 色谱图中最末峰的保留时间（min）tg tf-titx (tf-ti)/2UV 紫外光Vm 色谱柱的死体积（mL） ，Vm=t
14、0FVMA 香草扁桃酸 Vanillymandelic acidwm 化合物的进样量w1,w2 相邻谱峰 1 和谱峰 2 于半峰高处（W1/2）的宽度（ min）W1,W2 相邻谱峰 1 和谱峰 2 的基线宽度（min）W1/2 半峰高处的谱带宽度xd,xe,xn 溶剂选择参数，分别用于测定溶剂的酸度、碱度和偶极性的程度 ? 分离因子，?=k2/k1? 梯度洗脱期间流动相成分的变化?o 溶剂强度参数? 化合物的克分子吸收系数? 流动相的粘度（Pa?s)? 流动相中强溶剂的体积份数%B 二元流动相中强溶剂的体积百分比（%v）液相色谱法简介气相色谱不能由色谱图直接给出未知物的定性结果，而必须由已知
15、标准作对照定性。当无纯物质对照时，定性鉴定就很困难，这时需借助质谱、红外和化学法等配合。另外大多数金属盐类和热稳定性差的物质还不能分析。此缺点可高效液相色谱法来克服。在经典液相色谱的基础上，引入了气相色谱的理论与技术，在 70 年代初建立了高效液相色谱分析法（以 HPLC 表示） 。在常压下操作的液相色谱，分离一个样品往往长达几小时至几十小时，因此工作效率很低。人们曾对这种经典液相色谱法试用了柱前加压或柱后减压的办法来提高流速，以缩短分离时间，但是结果失败了。根据液相色谱理论，因为随着载液（流动相）流速的提高，板高则增大，所以柱效会显着降低。随着生产技术的提高，人们制成了细小（10?m）而高效
16、的填充物，从而使柱效大大提高。但是随着填充物粒度的减小，柱压降显着增大，为了得到合理的载液流速，使用了高压；输液泵，使流速达到110mL/min。从而使分析一个多组分样品只需几分钟到几十分钟时间。随着高效固定相、高压泵和高灵敏度检测器以及电子技术和计算机技术的应用，70 年代以业逐步实现了液相色谱分析的高效、高速、高灵敏和自动化操作。因此人们常称它为高效液相色谱或现代液相色谱，以区别于经典液相色谱。高效液相色谱法的分类与经典液相色谱法一致。按固定相的聚集状态不同分为液固色谱法和液液色谱法。按分离原理不同分为吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱和凝胶色谱法四类。高效液相色谱所用基本概念：保留值等色谱分析有关术语，以及分配系数、分配比、塔板高度、分离度、选择性等方面均与气相色谱相一致；高效液相色谱所用基本理论：塔板理论与速率理论也与气相色谱一致。因液相色谱以液体代替气相色谱中的气体作流动相，则速率议程 H=A+B/?+C?。式中：纵向扩散项（分子扩散
