《天花粉蛋白对宫颈癌 Caski 细胞DNMT1基因表达及酶活性的影响（毕业设计-妇产科学专业）》由会员分享，可在线阅读，更多相关《天花粉蛋白对宫颈癌 Caski 细胞DNMT1基因表达及酶活性的影响（毕业设计-妇产科学专业）（45页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、分类号 R71 密级U D C 100211硕 士 学 位 论 文天花粉蛋白对宫颈癌 Caski 细胞DNMT1 基因表达及酶活性的影响学 位 申 请 人： 宋 华 梅学 科 专 业： 妇 产 科 学指 导 教 师 ： 黄 利 鸣 教授王 艳 林 教 授佐 满 珍 教 授二 一 一 年 五 月三 峡 大 学 硕 士 学 位 论 文A Dissertation Submitted in Partial Fulfillment of the Requirements for theDegree of Master of MedicineThe Effect of Trichosanthin on
2、DNMT1 Expression andEnzyme Activity in Caski cellGraduate Student: Song HuameiMajor: Gynecology and ObstetricsSupervisor: Prof. Huang LimingProf. Wang YanlinProf. Zuo ManzhenChina Three Gorges UniversityYichang, 443002, P.R.ChinaMay, 20112三 峡 大 学 硕 士 学 位 论 文三 峡 大 学 学 位 论 文 原 创 性 声 明本 人 郑 重 声 明 ： 所 呈
3、 交 的 学 位 论 文 ， 是 本 人 在 导 师 的 指 导 下 ， 独 立 进 行 研 究工 作 所 取 得 的 成 果 ， 除 文 中 已 经 注 明 引 用 的 内 容 外 ， 本 论 文 不 含 任 何 其 他 个 人 或集 体 已 经 发 表 或 撰 写 过 的 作 品 成 果 。 对 本 文 的 研 究 做 出 重 要 贡 献 的 个 人 和 集 体 均已 在 文 中 以 明 确 方 式 标 明 ， 本 人 完 全 意 识 到 本 声 明 的 法 律 后 果 由 本 人 承 担 。学 位 论 文 作 者 签 名 ：日 期 ：三 峡 大 学 研 究 生 知 识 产 权 承 诺 书
4、本 人 承 认 ： 我 作 为 三 峡 大 学 硕 士 研 究 生 在 校 学 习 期 间 ， 在 导 师 指 导 下 ， 依 据 研 究工 作 所 作 学 位 论 文 的 知 识 产 权 全 部 权 归 三 峡 大 学 所 有 。本 人 承 诺 ： 我 有 义 务 维 护 三 峡 大 学 的 知 识 产 权 ， 凡 是 以 我 本 人 学 位 论 文 内 的 全 部或 部 分 研 究 成 果 ， 或 实 验 数 据 为 基 础 所 形 成 的 研 究 论 文 及 成 果 ， 无 论 是 以 何 种 形 式 刊发 学 术 论 文 、 进 行 成 果 鉴 定 或 申 报 奖 励 ， 均 以 三
5、峡 大 学 为 第 一 作 者 单 位 或 完 成 单 位 ，并 事 先 征 得 导 师 或 学 校 相 关 部 门 的 同 意 。我 愿 承 担 因 违 背 上 述 承 诺 而 引 起 的 一 切 法 津 和 经 济 后 果 。学 位 论 文 作 者 签 名 ：日 期：I（ 1三 峡 大 学 硕 士 学 位 论 文内 容 摘 要目的： 研 究 反 义 DNMT1 对 人 宫 颈 癌 Caski 细 胞 增 殖 和 生 长 周 期 的 影 响 ， 以 及 对Caski 细 胞 中 抑 癌 基 因 APC （ Adenomatous Polyposis Coli APC）的表达及其 5 端启 动
6、 子 区 CpG 岛 甲 基 化 状 态 的 影 响 ； 研 究 天 花 粉 （ Trichosanthin， TCS） 蛋 白 对 宫 颈癌 Caski 细 胞 DNMT1（ DNA- methyltransferase， DNMT） 基 因 的 表 达 和 酶 活 性 的 影响 ， 并 探 讨 天 花 粉 蛋 白 抗 宫 颈 癌 及 去 甲 基 作 用 的 分 子 机 制 ， 寻 找 新 型 去 甲 基 化 药 物 。方 法 ： 利 用 成 功 构 建 的 反 义 DNMT1 真 核 表 达 质 粒 pCMV-THM 转 染 Caski 细 胞 ， G418筛 选 ， RT-PCR 和 W
7、estern- blotting 法 鉴 定 低 表 达 DNMT1 的 细 胞 株 ， MTT 法 、 流 式 细胞 术 分 析 反 义 DNMT1 基 因 转 染 对 Caski 细 胞 增 殖 的 影 响 ； RT- PCR、 实 时 荧 光 定 量 PCR、Western-blotting 和 甲 基 化 特 异 性 PCR 法 研 究 反 义 DNMT1 基 因 转 染 对 Caski 细 胞 APC的 表 达 及 甲 基 化 状 态 的 影 响 。 应 用 RT-PCR、 实 时 荧 光 定 量 PCR 和 Western-blotting分 析 检 测 天 花 粉 蛋 白 对 宫
8、 颈 癌 Caski 细 胞 DNMTI 基 因 表 达 的 影 响 ； 应 用 DNMT1 酶 活 性试 剂 盒 检 测 天 花 粉 蛋 白 对 DNMT1 酶 活 性 的 影 响 。结果： ） 成 功 获 得 低 表 达 DNMT1 基 因 的 Caski 细 胞 株 ， 细 胞 生 长 实 验 显 示 DNMT1低 表 达 对 细 胞 增 殖 有 抑 制 作 用 ， 并 能 够 显 著 增 加 G1 期 的 细 胞 数 （ 由 50.1%增加到 58%） 。（ 2） 转 染 pCMV-THM 质 粒 的 Caski 细 胞 中 APC 基 因 mRNA 表 达 水 平 升 高 3.45
9、倍 ， 同时 APC 蛋 白 表 达 水 平 也 明 显 升 高 ； MSP 法 检 测 发 现 DNMT1 表 达 抑 制 导 致 APC 基 因 启 动子 区 去 甲 基 化 。 （ 3） 经 20、 40、 80g/ml 天花粉蛋白处理 24h 后 ， Caski 细 胞 中 DNM1基 因 mRNA 表 达 水 平 分 别 降 低 了 39%、 72%、 79%， 其 蛋 白 表 达 水 平 也 随 着 药 物 浓 度 增高 而 明 显 降 低 ； 用 DNMT1 活 性 试 剂 盒 检 测 显 示 20、 40g/ml 天花粉蛋白对 DNMT1 酶 抑制 率 分 别 是 31.3 和
10、 56.7%。结论：（ 1） 在 人 宫 颈 癌 Caski 细 胞 中 DNMT1 为 高 表 达 ， 降 低 DNMT1 基因表达水平能 抑 制 细 胞 的 增 殖 ， 提 示 DNMT1 可 作 为 宫 颈 癌 治 疗 的 一 个 靶 点 。（ 2） Caski 细 胞 低 表达 DNMT1 能 诱 导 启 动 子 区 CpG 岛 去 甲 基 化 而 使 APC 基 因 表 达 上 调 ， 从 而 恢 复 抑 癌 基 因的 功 能 。 （ 3） 天 花 粉 蛋 白 去 甲 基 化 的 作 用 可 能 是 通 过 降 低 DNMTs 的 表 达 和 抑 制 DNMTs的 活 性 而 实 现
11、 的 。 上 述 研 究 提 示 ， 天 花 粉 蛋 白 可 用 作 DNMTs 抑 制 剂 ， 具 有 潜 在 的 临 床应 用 价 值 。关键词：天花粉蛋白 DNMT1 基因 APC 基 因 宫 颈 癌 DNA 甲基化II三 峡 大 学 硕 士 学 位 论 文AbstractObjective： To study the effects of antisense DNMT1 on human cervical carcinomaCaski cell line in: 1) the proliferation and cell cycle, 2) expression of tumor su
12、ppressorgene APC （ Adenomatous Polyposis Coli） and methylation status in its promoter CpGisland; To study the effects of Trichosanthin (TCS) on expression and enzyme activity ofDNMT1 in Caski cervical cancer cell line, and to explore the underlying mechanism ofTCS in anti-cervical cancer as a demeth
13、ylation drug.Methods： Eukaryotic expression plasmid (pCMV-THM) that contains antisenseDNMT1 was transfected into Caski cells and the cell lines with DNMT1 expressioninhibition were selected by RT-PCR and Western blotting. MTT assay and flowcytometrywere used to elucidate the effects of antisense DNM
14、T1 on cell growth and cycle regulation;RT-PCR, Real Time PCR,Western blotting and MSP were used to investigate the effects ofantisense DNMT1 on methylation and expression of APC gene. RT-PCR, real-time PCRand Western-blot assay were used to detect expression of DNMT1 gene in Caski cell lineafter TCS
15、 treatment. The enzyme activity of DNMT1 was detected by DNMT1 ActivityScreening Assay Kit.Results：（ 1） The Caski Cell lines with low expression of DNMT1 were obtainedsuccessfully. Inhibited cell growth and increased G1 population (from 50.1% to 58%) inthe cell cycle were observed in these cell line
16、s. （ 2） Transfected with antisense DNMT1resulted in upregulated expression of APC in protein or mRNA levers and demethylation ofAPC gene promoter.（ 3） Treating the Caski Cells with 20g/mL、 40g/mL or 80g/mLTCS resulted in a 39 、 72%、 79% decrease in DNMT1 mRNA level respectively andalso a great decrease in DNMT1 protein level. The inhibition rate for DNMT1 enzymeactivity was 31.3 、 56.7% respect
