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1、LCMSMS 同时测定大鼠血浆中瑞香素、西瑞香素和瑞香新素及其药代动力学研究摘要 建立同?r 测定大鼠灌胃祖师麻提取物后血浆中瑞香素、西瑞香素和瑞香新素的 HPLC-MS/MS分析方法，并用于计算 3个成分在大鼠体内的药代动力学参数。试验采用 6只 SD大鼠，口服给予祖师麻提取物 （瑞香素、西瑞香素和瑞香新素的给药量分别是 88.40，3.24，4.28 mg?kg-1） ，以五味子醇甲为内标，用 LC-MS/MS测定给药后血浆中药物浓度，绘制血药浓度-时间曲线，并用 Kinetica 4.4软件计算相关药代动力学参数。试验结果显示，瑞香素、西瑞香素和瑞香新素的线性范围均为 51 000 g?
2、L-1，方法学考察符合要求。日内、日间变异系数（RSD）均小于15%，精密度和准确度符合生物样品分析要求。瑞香素、西瑞香素和瑞香新素口服给药后的 Tmax分别为 4，2.92，2 h； Cmax 分别为 858.96，178.00，36.67 g?L-1；AUC0-t分别为 10 566.4，905.89，355.11 g?L-1?h； 半衰期t1/2分别为 5.19，3.50，4.95 h；平均驻留时间 MRT分别为 9.43，6.95，8.27 h。因此，该研究建立的 LC-MS/MS分析方法准确灵敏，适于对 SD大鼠口服祖师麻提取物后的瑞香素、西瑞香素和瑞香新素的药代动力学研究。 关键词
3、 LC-MS/MS； 祖师麻； 瑞香素； 西瑞香素；瑞香新素； 药代动力学 Abstract To establish HPLC-MS/MS method for simultaneous determination of daphnetin， daphnoretin， and daphneticin in rat plasma after oral and intravenous administration of Daphne giraldii extract， and then use them in the calculation of pharmacokinetic paramete
4、rs. Six sprague-dawley rats received intragastric administration of D. giraldii extract （daphnetin， daphnoretin and daphneticin were 88.40， 3.24 and 4.28 mg?kg， respectively）. Their drug plasma concentration was determined by LC-MS/MS with schisandrin as an internal standard to draw plasma concentra
5、tion-time curve. The pharmacokinetic parameters were calculated by Kinetica 4.4. The results showed that the linear range was 5-1 000 g?L-1 for daphnetin， daphnoretin and daphneticin， and the method ological test showed conformance to the requirements.The intraday and inter-day variable coefficients
6、 （RSD） were both less than 15.0%， indicating that both of legitimate precise and accuracy were consistent with the analysis requirements of biological samples. For daphnetin， the pharmacokinetic parameters Tmax， Cmax， AUC0?Ct， T1/2 and MRT were 4 h， 858.96 g?L-1， 10 566.4 g?L-1?h， 5.19 h and 9.43 h，
7、 respectively. For daphnoretin， the pharmacokinetic parameters Tmax， Cmax， AUC0?Ct， T1/2 and MRT were 2.92 h， 178.00 g?L-1， 905.89 g?L-1?h， 3.50 h and 6.95 h， respectively. For daphneticin， the pharmacokinetic parameters Tmax， Cmax， AUC0?Ct， T1/2 and MRT were 2 h， 36.67 g?L-1， 355.11 g?L-1?h， 4.95 h
8、 and 8.27 h， respectively. The LC-MS/MS analysis method established in this study was proved to be so accurate and sensitive that it can be applied to the pharmacokinetic study of daphnetin， daphnoretin and daphneticin. Key words LC-MS/MS； Daphne giraldii； daphnetin； daphnoretin； daphneticin； pharma
9、cokinetic 祖师麻为我国民间传统常用中药，长久以来一直用于治疗风寒湿邪侵袭而致的风湿性关节炎、类风湿性关节炎引起的疼痛等相关症状，并取得了良好的效果。根据文献记载瑞香属植物黄瑞香 Daphne giraldii Nitsche，凹叶瑞香 D. retusa Hemsl，长白瑞香 D. koreana，陕甘瑞香 D. tangutica Maxim以及同科结香属植物结香 Edgeworthia chrysantha Lindl.均可作为祖师麻入药，入药部位为干燥茎皮及根皮。收载于 1977年版中国药典1一部。近年来从祖师麻中分离并鉴定的化合物主要包括香豆素、木脂素类、黄酮类、二萜类等多种
10、化学成分。其中香豆素?成分瑞香素、瑞香新素和西瑞香素等，因其显著的抗炎、镇痛2-8、抗肿瘤9-11等生物活性而被国内外广泛研究。 通过查阅国内外文献，发现目前有文章报道研究了瑞香素单体不同给药途径在大鼠体内的药代动力学12及甘草提取物对瑞香素大鼠体内的药代动力学影响13；西瑞香素单体不同给药途径在大鼠体内的药代动力学14及其在大鼠体内的组织分布情况15-17。但是关于同时测定祖师麻提取物中瑞香素、西瑞香素和瑞香新素 3个成分在大鼠体内药代动力学的研究，尚未见任何报道。本文旨在建立高效、灵敏的 LC-MS/MS用于测定大鼠口服祖师麻提取物后瑞香素、瑞香新素和西瑞香素的血药浓度，并用于祖师麻提取物
11、在大鼠体内的药代动力学研究。 1 材料 液相色谱串联质谱仪（6460 Triple Quad LC-MS，Agilent Technologies） ；XP26 型 1/1 000电子天平（Mettler Toledo） ；3K15 型冷冻高速离心机（Sigma，14 000 r?min-1） ；旋蒸浓缩仪（Labconco，60 孔） ；XW-80A旋涡混合器（江苏海门市麒麟医用仪器厂） ；移液枪（Gilson，1 000，200，100，10，2 L） 。 瑞香素对照品（批号 110900-201006，纯度 98%） ，购自中国食品药品检定研究院；西瑞香素对照品（批号2548/18557
12、，纯度 98%）和五味子醇甲（内标，批号2329/21056，纯度 98%） ，均购自于上海诗丹德生物技术有限公司； 瑞香新素（自制，纯度大于 98%） 。甲醇和乙腈为色谱纯，购自 Fisher Scientific；甲酸，纯度 88%，购自赛默飞世尔科技有限公司；水为 Cascada 超纯水系统，Pall Corporation公司；其他试剂均为分析纯。祖师麻药材由秦皇岛市山海关药业有限责任公司提供，北京中医药大学刘春生教授鉴定为瑞香科植物黄瑞香 D. giraldii的干燥茎皮及根皮。 SD 大鼠，雄性，体重（25020）g，合格证号SCXK（京）2012-0001，购自北京维通利华有限责
13、任公司。 2 大鼠血浆中 3种成分的 LC-ESI-MS/MS同时测定方法的建立 2.1 色谱条件 Agilent 5 TC-C18 色谱柱 （4.6 mm250 mm，5 m） ； 流速 1 mL?min-1；检测波长 320，344 nm；柱温 25 ；以 0.1%磷酸水溶液为流动相 A，乙腈为流动相 B，梯度洗脱，010 min，5%15% B；1040 min，15% B；4050 min，15%35% B；5070 min，35% B；7080 min，35%95% B；8081 min，95%5% B；8190 min，5% B。 2.2 质谱条件 离子源为电喷雾电离 ESI；检测
14、方式为正离子模式；雾化气压力 45 psi（1 psi=6.895 kPa） ；保护气为氮气，流速 10 L?min-1；干燥气温度 350 ；毛细管电压 4 000 V；离子采集方式为多重反应监测（MRM） ，其余质谱参数见表 1。3 个成分以及内标五味子醇甲的质谱图见图 1，2。 2.3 标准溶液的配制 分别精密称取瑞香素对照品 10.09 mg、西瑞香素对照品 10.12 mg、瑞香新素对照品 10.05 mg，置于 10 mL量瓶中，瑞香素和西瑞香素用 85%甲醇、瑞香新素用甲醇定容至刻度，配制成瑞香素、西瑞香素、瑞香新素质量浓度分别为 1.009，1.012，1.005 g?L-1
15、的标准储备液。 精密移取 3个标准储备液适量，置于同一 10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，配制成分别含有 100 mg?L-1的中间混合标准溶液。再取上述中间混合标准溶液，以适宜溶剂进行系列稀释，依次获得瑞香素、西瑞香素、瑞香新素质量浓度为 10，8，5，2.5，1，0.5，0.25，0.1，0.05 mg?L-1的标准系列工作溶液。 精密称取五味子醇甲对照品 10.02 mg，置于 10 mL量瓶中，用甲醇溶解定容，配制成质量浓度为 1.002 g?L-1的标准储备液。临用时再用甲醇稀释为 1 mg?L-1的标准工作溶液。 2.4 血浆样品的制备方法 取 1.5 mL的洁净 EP管，每管加
16、入 SD大鼠空白血浆100 L，每管里依次精密加入质量浓度为10，8，5，2.5，1，0.5，0.25，0.1，0.05 mg?L-1 的标准系列工作溶液 10 L，漩涡混合 30 s后分别精密加入质量浓度为 1 mg?L-1的五味子醇甲内标溶液 10 L，漩涡混合30 s，加 500 L 甲醇-乙腈（11）溶液沉淀蛋白，漩涡30 s，置 14 000 r?min-1离心机中离心 5 min，同法沉淀2次，共得上清液 1 000 L，置旋蒸浓缩仪 30 蒸干 3 h，蒸干后残渣加入 100 L 20%甲醇-乙腈（11）复溶，漩涡 5 min，14 000 r?min-1 离心 20 min，取上清，即得。2.5 方法学考察 2.5.1 方法的选择性 取 SD大鼠空白血浆 100 L，按2.4项下进行处理，用 LC-MS/MS方法进行分析，获得 SD大鼠空白血浆样品的色谱图；取受试 SD大鼠
