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1、核酸扩增检测结果的分析及阳性结果的确认程序 卫生部临床检验中心 王露楠 血站与医院临床核酸扩增检测的差异 血 站 临床实验室 目 的 缩短检测“窗口期” 感染性疾病的诊断和治疗监测 测定下限 定性测定，越低越好 定性或定量测定 测定策略 单人份或多人份混合 单人份 技 术 PCR和 TMA PCR+产物分析（测序、杂交等） 对标本制备的要求 对标本必须进行核酸纯化，且必须自动化 对核酸纯化要求低，多为手工操作 对加样量和反应体积的要求 应尽可能大，决定了检测的敏感性 稍低些（相对于血站） 服务对象 受血者 被检者（患者） 血站核酸扩增检测国内目前所用的试剂及方法特点 上海科华 上海浩源 中山达
2、安 ROCHE Grifols 方法 实时荧光PCR 实时荧光 PCR 实时荧光PCR 多重实时荧光PCR TMA 内标 有 有 有 有 有 HBV、HCV、 HIV检测模式 各指标分管检测 1）分管检测； 2）一管内多重 PCR，但直接检测三项指标。 各指标分管检测 一管内多重PCR，不能区分是何指标 一管内联合检测先不区分，反应性样本再行单个指标检测 检测系统的组成 HAMILTON混样仪、提取仪、实时荧光 PCR仪 HAMILTON混样仪、提取仪、实时荧光 PCR仪 chemagicSTAR全自动核酸提取仪 、实时荧光PCR仪 HAMILTON Microlab STAR IVD Pip
3、ettor混样仪、 COBAS AmpliPrep Instrument全自动核酸提取仪、 COBAS TaqMan Analyzer和 the Pooling and Data Management (PDM) Software TECAN混样仪（如混合样本）、TMA检测仪（一管内完成提取、扩增及杂交发光检测） 实时荧光定量 PCR检测的结果分析报告 线性基线期 (Linear base-line phase) 指数期初期 （ The beginning of exponential phase） 指数期（ Exponential phase） 平台期（ Plateau phase） Ct值
4、（ threshold cycle）或 CP值（ crossing point） 指的是实时监测扩增过程的荧光信号达到指数扩增时的循环周期数。 有内标的实时荧光 PCR 核酸实时荧光 PCR检测结果 三管三项（ HBV、 HCV、 HIV）检测：分别报告阳性（反应性）或阴性（非反应性） 一管三项检测 ：（ 1）不明确鉴别何种病毒报告反应性或非反应性（ ROCHE）；（ 2）多重多色荧光检测，直接报告 HBV、 HCV和 HIV-1 阳性或阴性 需要明确的几个概念 检测下限 灵敏度 检测限 （最低检出限） Limit of Detection， LoD 样本中可能被检出的分析物的最低数量（通常指
5、在常规的实验室条件下 95%的样本可被检出） 定量范围 精密度 准确度 试剂 检测系统 核酸检测 -检测系统的性能指标 HBV DNA Concentration (IU/mL) Number of Reactives Number of Individual Tests % Reactives 95% Lower Confidence Limit (one-sided) 12.0 189 189 100.0% 98.4% 5.0 194 197 98.5% 96.1% 4.0 182 189 96.3% 93.2% 3.6 186 197 94.4% 90.9% 1.3 129 200 64
6、.5% 58.5% 0.4 47 191 24.6% 19.5% TMA结果 Relative Light Units (RLU) S/CO比值 1.00为反应性（ IC 650,000 RLU ）； S/CO比值 1.00为无反应（ IC IC Cutoff ，同时，IC 650,000 RLU ） 进一步鉴别检测 应采用具有相应检测下限的试剂，对不能鉴别 HBV、 HCV和 HIV检测反应性样本进行鉴别检测。 在目前情况下，建议采用国产核酸扩增检测试剂进行鉴别检测。 核酸检测 -检测系统的性能指标 HBV DNA Concentration (IU/mL) Number of Reacti
7、ves Number of Individual Tests % Reactives 95% Lower Confidence Limit (one-sided) 12.0 189 189 100.0% 98.4% 5.0 194 197 98.5% 96.1% 4.0 182 189 96.3% 93.2% 3.6 186 197 94.4% 90.9% 1.3 129 200 64.5% 58.5% 0.4 47 191 24.6% 19.5% 乙型肝炎标志物检测结果分析 面临的问题 疾病本身 1. 感染的人口比例： HBsAg 阳性 7.18% 2. 感染状态：多样性、易变性 3 . 预
8、后：非活动性病毒携带者发展为慢性乙肝，可能进展为肝硬化、 肝细胞性肝癌 ； 乙型肝炎病毒感染相关终末期肝病或肝细胞性肝癌导致每年 50-100万人死亡，并且 5-10%进行肝移植。 4. 影响因素：宿主和病毒的因素，包括和其他病毒的共感染、饮酒、肥胖都是影响疾病进程和治疗效果的重要因素。 99 121 124 107 137 138 139 147 149 G D E D 164 R E 145 144 F Y 158 s-s- s-s- -s-s- -s-s- M I 195 S W M I 196 198 210 Loop 1 of a determinant Loop 2 of a de
9、terminant (Carman, W. J Viral Hepatitis 1997 4: 11-20, modified) 疫苗逃逸突 变 株 : T126S T131N M133L K141E D144E G145R 126 141 131 133 诊 断逃逸突 变 株 : P120T/A/Q D144A T131K G145R 抗病毒耐 药 突 变 株 I195M W196S M198I 试剂方法的改进与局限 120 疫苗逃逸突 变 株 : T126S T131N 诊 断逃逸突 变 株 : P120T/A/ 抗病毒耐 药 突 变 株变 株诊 断逃逸突 变 株试剂方法的改进与局限 核酸
10、检测 定性检测 定量检测 主要通过对乙肝患者血中 HBV DNA基线水平和变化情况的监测，用于评估抗病毒治疗的应答和治疗效果监测 最低检出限 ： 95%以上阳性检出率的病毒水平作为最低检出限。 线性范围？准确定量的范围？ 检测项目的意义 慢乙肝中 HBsAg和 HBV DNA 的意义不同 HBV DNA HBsAg 检测物 Dane 颗粒 Dane 颗粒 和 亚病毒颗粒 病毒学 反映 HBV 病毒的复制情 况 反映的是 cccDNA的水平 临床意义 是否抑制病毒复制 感染的肝细胞的免疫清除 HBV隐匿性感染的定义 肝脏有 HBV DNA复制且血清中未检测到HBsAg（血清中 HBV DNA或有
11、或无） 有别于窗口期 一般都为 HBcAb阳性（其中约 50%HBsAb也为阳性） 很少一部分为单独 HBsAb阳性 没有抗体的初期隐匿性感染 Raimondo et al, J Hepatol 2009 HBV感染后血液中指标的出现 隐匿性 HBV 感染的不同状况 1. 既往 HBV 感染。可表现为 HBV DNA和抗 HBS 阳性 ; 或 HBV DNA 和抗 HBc 阳性 , 但抗 HBS 水平低于可检测水平。 2. 急性 HBV 感染恢复期。 HBsAg 阴性 , 但抗 HBS 尚未出现 , 此时仅抗 HBc阳性 . 3.慢性 HBV感染。 HBV DNA阳性 , 但存在免疫逃逸突变
12、, 不能被患者体内的抗 HBs 及常规诊断试剂中的抗 HBs 单克隆抗体识别 ; 或者无免疫逃逸突变 ,但血清学标志物均为阴性 , 而 HBV DNA 阳性。 4.无症状 HBV携带者 ,无免疫逃逸突变 , 但抗 HBc阳性 , 抗 HBe 阳性或阴性 ;或 HBV DNA 阳性 , 但血清学标志物均为阴性。 实验室检测指标 HBcAb和 HBV DNA HBV DNA 含量 全部阴性 单独 HBsAb阳性 HBcAb阳性 162 55 584 20IU/ml 60 31 492 20-50IU/ml 26 4 52 50-100IU/ml 20 9 20 100IU/ml 56(108-34
13、600IU/ml) 11 (140、576IU/ml) 20 (133、4610IU/ml) 实验室检测指标 HBcAb? HBV DNA 结果 全部阴性 单独 HBsAb阳性 HBcAb阳性 阳性例数 162 55 584 % 15.49 5.26 55.83 阴性例数 156 158 749 % 13.13 13.30 63.05 乙型肝炎标志物检测结果分析 表面抗原阳性 核酸阳性 表面 抗原阴性 没有表面抗原 核酸 阳性可能为多种感染状况： 窗口 期、慢性乙肝 . 血清学检测是重要的验证和补充实验 HBsAb和 HBcAb是重要指标 丙型肝炎标志物检测结果分析 0501001502002
14、503003504001.01-5.00 5.01-8.0 8.01-20 20HCV RNA阳性和阴性的样本 的 化学发光检测结果 S/Co分布 RNA阳性总数 RNA阴性总数 HCV感染的特点 我国一般人群抗 -HCV阳性率为 3.2%；各地抗 -HCV阳性率有一定差异，以长江为界，北方高于南方；随年龄增长而逐渐上升；男女间无明显差异。 HCV传染源包括患者和隐性感染者，传播途径多种多样，包括： 1.血液传播，如注射毒品、输血或血制品、血液透析、器官移植等 2.经破损的皮肤和黏膜传播，这是目前最主要的传播方式 3.母婴传播 4.性接触传播 部分 HCV感染者的传播途径不明。接吻、拥抱、喷嚏
15、、咳嗽、食物、饮水、共用餐具和水杯、无皮肤破损及其他无血液暴露的接触一般不传播 HCV。 中国部分农村地区 HCV流行率亦较高 HCV感染者的疾病进展与预后 丙肝起病隐匿，部分患者无明显症状， 30%慢性丙肝患者 ALT正常 丙肝感染的慢性化率非常高，并且将导致肝硬化、肝癌等严重后果 5080% 慢性HCV感染 6070% 慢性肝脏病变 5 20% 肝硬化 1 5% 死亡 www.cdc.gov/hepatitis/HCV/HCVfaq.htm. FAQs for Health Professionals. 中国临床报告丙肝病例逐年递增 21145 39380 52927 70681 92378 108446 131849 153039 1
