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1、第三章 赖氨酸发酵过程优化第一节、赖氨酸发酵概述 赖氨酸是一种碱性氨基酸，是仅次于谷氨酸的第二大氨基酸产品，是谷物蛋白的第一限制性氨基酸，在谷物食料中添加适量的赖氨酸，其蛋白质的生物价大大提高。 赖氨酸的应用范围很广。作为食品强化剂；作为药物可用作肝细胞再生剂，对改善肝功能，治疗肝硬化、高氨症，增进食欲、改善营养状况有明显的疗效；作为饲料添加剂，在畜、禽类的饲料中添加少许的赖氨酸，对家禽、家畜的日增重、料肉比、家禽的产卵量等方面效果尤为显著。,一、发酵法生产赖氨酸技术的发展 1、赖氨酸的生产方法 水解法(已淘汰)、合成法、酶法和直接发酵法。 合成法：以己内酰胺、二氢吡喃、环己酮、呱啶为原料合成
2、L-赖氨酸已有报道，但还没有大规模的生产报道，主要是合成法制成的中间体DL-赖氨酸进一步的分离工艺很复杂。 酶法（3种）：合成-苯甲酰-乙酰-DL-赖氨酸，采用消旋酶处理制成-苯甲酰-L-赖氨酸，经酸水解得产品；合成DL-4-氨基丁基乙内酰脲，采用微生物酶使其转变为L-赖氨酸；由环己烯合成DL-氨基己内酰胺，采用水解酶和消旋酶共同作用使其变成L-赖氨酸。,第三种工艺已用于赖氨酸工业化生产。该法发明者富村隆最初找到了可水解L-氨基己内酰胺的罗伦隐球酵母，然后发现了具有DL-氨基己内酰胺消旋酶活性的无色杆菌，通过这两种细菌的共同作用， DL-氨基己内酰胺被转化为L-赖氨酸，且得率高。 发酵法：原料
3、来源广泛，且生产的赖氨酸均为L-型，在赖氨酸的生产中占据了主导地位。生产赖氨酸的主要厂家见表4-1，其中90%以上的企业采用发酵法生产。 2、发酵法生产赖氨酸 微生物的赖氨酸合成途径在1950年以后逐渐被阐明。,对结肠芽孢杆菌、黄色短杆菌和乳糖发酵短杆菌的赖氨酸合成途径解析后发现：赖氨酸的合成与其它氨基酸不同，存在两条途径即：二氨基二酸途径和-氨基乙二酸途径，前者存在于细菌、绿藻、原生质、高等植物中，后者存在于酵母菌、霉菌中。 1957年，日本开始采用野生菌株发酵生产谷氨酸，1960年用谷氨酸棒杆菌的高丝氨酸缺陷型变异株生产赖氨酸。 20世纪60年代中期，我国开始赖氨酸发酵菌株和工艺条件研究。
4、1974年中科院微生物所诱变北京棒杆菌AS 1.229得到营养缺陷型变异株AS 1.563，产酸17.9g/L，进一步诱变得到AECr变异株，产酸50g/L。,70年代后期，上海、黑龙江、广西和江苏等地积极开展赖氨酸菌种筛选工作。如上海天厨味精厂得到AECr和高丝氨酸缺陷双突变株，产酸3637g/L；中科院微生物所和常州味精厂合作筛选得到产酸4853g/L的钝齿棒杆菌，通过发酵中试技术鉴定。上海工业微生物研究所从黄色短杆菌2030出发经诱变筛选得到抗性和营养缺陷型双突变株，其中的FH-128菌株在16L小罐发酵70h产酸130g/L以上，5m3罐中试发酵6569h，产酸92.295g/L，转化
5、率为40.2%左右，达到国际先进水平，但至今未有工业化报道。,广西南宁赖氨酸厂于80年代投产后，与广西生物化工研究所协作一直进行赖氨酸生产菌改良和发酵工艺改进，得到分别以糖蜜和淀粉糖为原料的高产菌株，以淀粉糖为原料30L罐发酵产酸120130g/L左右，该厂还获得了可耐高温生产菌，37下发酵，赖氨酸产量基本不受影响。 江南大学20世纪80年代从谷氨酸产酸菌AS 1.495诱变赖氨酸产酸菌F11-519，产酸57.4g/L。再经原生质体融合和化学、物理诱变等手段得到多重变异株FB21，摇瓶产酸70g/L，为当时的国内领先水平，但未进行发酵中试和工业化。,综上所述，国内赖氨酸研究起步较早，但高产菌
6、实现工业化比例低；另外，研究多局限于菌种改良和优化发酵的环境条件，对各种培养条件下的优化控制研究不多，或与实际生产脱节。 3、我国赖氨酸发酵工业现状 20世纪80年代初，国内开始进行赖氨酸发酵中试，并兴建赖氨酸发酵厂，特点是产酸水平和转化率低、规模小。“七五”期间，国家在广西南宁、福建泉州、湖北武汉及吉林九站建了4套年产1kt赖氨酸生产装置。后两家已经改产或停产，福建泉州赖氨酸厂1989年与正大集团合资后改名为“泉州大泉赖氨酸有限公司”，生产能力5kt/a左右，使用国外菌种和技术。广西南宁赖氨酸厂具有6kt/a生产能力。此外，还有四川川化味之素公司具有6kt/a生产能力，使用日本菌种和技术。,
7、以上三家企业为我国最主要的赖氨酸生产厂家，其总生产能力也不过略高于1.5万t/a，而仅美国ADM公司年产赖氨酸就达12万t/a。广西南宁赖氨酸厂是唯一拥有自己的菌种和技术的国内赖氨酸生产企业，该厂主要以糖蜜为原料，产酸达到80g/L以上，对糖转化率38%左右，在国内属先进水平。但跟日本等国的赖氨酸生产水平（日本味之素公司发酵法生产赖氨酸盐酸盐浓度为120g/L，转化率可达50%）相比有很大差距。 二、赖氨酸发酵研究的目的和主要内容 赖氨酸在我国具有广阔的市场，我国赖氨酸生产技术虽然取得了长足的进步，但与国外先进水平相比（如产酸水平、糖酸转化率、提取率、生产规模、电耗、生产成本比值）都存在差距。
8、,发酵水平的高低是工厂的命脉，提高发酵水平有两条途径：一是筛选出优良的菌株；二是得出与目的菌株相匹配的最佳培养条件、控制手段，只有两者紧密结合才能最终实现发酵的高水平。后者正在占据着越来越重要的地位。例如，味之素公司研究人员曾报道，乳糖发酵短杆菌变异株AJ11204在摇瓶条件下48h产赖氨酸为4.3%，但在小型发酵罐中，通过控制培养条件，48h产酸水平可提高到7%，类似的结果在其它发酵产品的研究中也时有报道。 我国学者对赖氨酸的研究长期以来都把工作重点放在高产菌株的选育上，有关如何对发酵过程进行优化与控制的研究较少。,实际生产需要的一些培养条件、技术指标往往在摇瓶条件下获得，这种低水平的研究方
9、法客观上制约了菌种潜力的充分发挥，不仅如此，由于在摇瓶条件下无法对目的微生物生理生化特性、营养供给及操作、发酵设备三者之间建立起有机的联系，当反应器规模发生变化时发酵结果常常不能重复。这是导致生产规模扩大而发酵水平降低的根本原因。 实现发酵过程最优化，使菌种的潜力充分发挥是发酵技术的最高境界。鉴于国内赖氨酸高产菌株多集中于黄色短杆菌，以此为研究菌株，陈坚等以实现流加发酵最优化为研究目的，在小型反应器上对黄色短杆菌发酵生产赖氨酸的过程进行了定量的解析。具体包括以下内容：,在所提供的出发株基础上，通过常规诱变获得一株赖氨酸产生菌FB42，在摇瓶条件下对可能影响代谢的环境因子进行了考察，对发酵条件进
10、行了优化； 以连续培养作为研究手段，考察了微生物的菌体生长、产物形成及基质消耗特性。通过代谢途径进行定量的质、能衡算，得出了赖氨酸的理论转化率。进一步比较理论转化率和FB42真实转化率之间的差异，对FB42的代谢流进行分析，据此得出对工艺研究有指导的一些理论依据； 在小型反应器中对影响赖氨酸形成的一些重要环境因子进行定量的考察，找出目的微生物的生理生化特性、营养源供给与反应器特性之间的内在联系，得出最适的操作条件。在此基础上进一步对发酵过程的动力学进行研究，建立起合理的动力学模型，为流加发酵的最优化研究打下基础；,在动力学研究的基础上对发酵进行最优化操作。包括状态方程的建立、目标泛函的确定、最
11、优化流加方式的求解。并通过实验对最优化操作进行检验，达到理论和实践的统一。第二节、赖氨酸生产菌FB42的获得 一、出发菌株FB21的遗传特性：P81 二、FB31菌株摇瓶发酵性能的初步研究 FB31是由FB21（主要遗传标记为Leu-Thr- AECrAHVr ）的保藏斜面中接出，经复壮、分离、纯化后获得。其主要遗传标记为Leu-、AECr、AHVr。 1、种龄的确定 适宜的种龄应是菌体处于对数生长期的中后期。因为处于对数生长期的菌体接种有利于缩短发酵周期，对数生长期末菌体浓度相对较高，更有利于保持高的接种量。,从图4-2的生长曲线上可看出，培养进行到1719h时，FB31处于对数生长期末，所
12、以选择种龄为1719h。 2、接种量对发酵的影响 培养1719h的新鲜种子按不同的接种量接入发酵培养基中，根据表4-3的结果，接种量以5%为好。 但进一步的实验又表明接种量以8%为好（表4-4）。 导致上述结果的根本原因在于缺乏菌体浓度作为衡量标准。接种量为5%时，菌体浓度较高（OD=0.180.2）;接种量为8%时，菌体浓度较低（OD=0.085）。 同样培养时间条件下引起菌体浓度出现差异的可能原因包括:温差、斜面接种量波动或其它因素。,3、初糖浓度对发酵的影响 表4-5的结果表明：初糖浓度13%时发酵的转化率最高，进一步提高初糖浓度对发酵不利，当初糖浓度为18%时，FB31几乎不产酸，说明
13、菌株不具备耐高糖的特性。 4、发酵培养基的优化 在固定葡萄糖、磷酸氢二钾、七水合硫酸镁和碳酸钙用量基础上，对玉米浆、豆饼水解液、硫酸铵等氮源物质通过正交实验，得出发酵培养基的最适组成为（g/L）： 葡萄糖130 玉米浆 30 豆饼水解液 10 硫酸铵 40 磷酸氢二钾 1 七水合硫酸镁 0.5 碳酸钙 45 用该培养基发酵72h，产酸为42g/L，和FB21（70g/L）相比产酸性能下降很多。结合遗传标记的改变、发酵产酸水平和耐糖能力的降低，表明FB31发生了回复突变。,防止回复突变目前通常采用如下办法： 选育遗传性能稳定的菌株。经诱变处理后，在易出现回复突变的培养基中反复传代，选出不发生回复
14、突变的菌株； 定向赋加生产菌的遗传标记。如选育双缺菌株，增加抗回复突变性能；对于抗性株，尽量选育多重抗性突变株； 在保藏过程中除选择合理的保藏方法外，对于营养缺陷型菌株要提供足够的营养物，抗性株可添加适量的抗性物质； 必须定期进行分离、纯化工作，保持其遗传性能的稳定。,三、赖氨酸生产菌FB42的获得 1、黄色短杆菌产赖氨酸的合成途径与调控机制 黄色短杆菌产12种氨基酸的合成代谢途径如图4-3所示。,葡萄糖,磷酸烯醇式丙酮酸,丙酮酸,乙酰辅酶,草酰乙酸,-酮戊二酸,天冬氨酸,丙氨酸,-酮戊二酸,丙氨酸,亮氨酸,缬氨酸,谷氨酸,天冬氨酸半醛,高丝氨酸,苏氨酸,蛋氨酸,赖氨酸,TCA,反馈阻遏,反馈
15、抑制,图4-3中，氨基酸的代谢途径有3条：从葡萄糖经丙酮酸到丙氨酸、缬氨酸；从葡萄糖经草酰乙酸和-酮戊二酸到谷氨酸；从葡萄糖经天门冬氨酸、天门冬氨酸半醛到赖氨酸、苏氨酸和蛋氨酸。 第三条代谢途径即赖氨酸合成途径存在着严格的调节机制，正常的细胞几乎不积累赖氨酸、苏氨酸和蛋氨酸。该调节机制由下面几种调节作用共同完成： 、谷氨酸优先合成，谷氨酸合成过剩就会抑制谷氨酸脱氢酶（GD）的活性，使得生物合成的代谢流转向天门冬氨酸。 天门冬氨酸的过剩也会抑制磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的活性，使得天门冬氨酸不致大量积累。,赖氨酸的前体物质天门冬氨酸与乙酰辅酶A的生成形成平衡合成，乙酰辅酶A的增加能逆转天门冬氨酸对其自身合成的反馈抑制。 天门冬氨酸激酶（AK）受赖氨酸与苏氨酸的协同反馈。 AK是一个变构酶，催化天门冬氨酸和ATP形成-天门冬氨酸磷酸，有两个变构位置可以接受末端产物。AK受赖氨酸与苏氨酸的协同抑制，当只有赖氨酸或苏氨酸与变构位置结合时，酶活影响不大，当赖氨酸与苏氨酸同时结合到两个变构位置时，酶活受到强烈的抑制。此外，AK是赖氨酸合成途径中唯一的反馈调节点。,
