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1、1模拟失重大鼠下丘脑不同部位的 Fos 和 GFAP 表达作者：宿长军饶志仁张立藩 【关键词】, 下丘脑 关键词: 下丘脑;基因，Fos;神经胶质原纤维酸性蛋白;失重模拟 摘要: 目的了解长期模拟失重状态下大鼠下丘脑功能活动状态.方法用 Fos 和胶质原纤维酸性蛋白（GFAP）的 ABC 法，分别检测4 周模拟失重大鼠下丘脑神经元和星形胶质细胞（AS）的变化.结果二者表达仅见于室旁核尤其大细胞部、视上核和视交叉上核，而其它部位未见表达;AS 胞体变大、突起增粗增长.结论下丘脑这些核团参与了对长期失重的反应，且可能与加压素分泌增加有关. Keywords:hypothalamus;gene，Fo
2、s;glialfibrillaryacidicprotein;weightlessnesssimulation Abstract:AIMToresearchthefunctionsofrathypothala-musunderlong-J2termsimulatedweightlessnesscondition.METHODSByusinganti-Fosandanti-GFAPimmunohis-tochemicalABCmethods，weobservedchangesofhypothala-musneuronsandastrocytesin4wksimulatedrats.RESULTS
3、ExpressionsofFos-andGFAP-positivecellswereonlyfoundinparavetricularnucleiofthehypothalamus，es-peciallyinmangocellularpart，supraopticnucleiandsuprachiasmaticnuclei，withnegativereactioninotherareas.Thereactiveastrocyteswerefeaturedwithhypertrophyof thecellbodyandcytoplasmicprocesses.CONCLUSIONThesenuc
4、leiinhypothalamusmayparticipateinthereactiontolong-termweightlessness，andprobablybeassociatedwithincreasedsecretionofvasopressure. 0 引言 下丘脑-垂体系统为调节机体机能的活跃区，航天引起的生理变化几乎都受神经内分泌的影响.失重是航天员无法消除的因素，失重后下丘脑-垂体系的变化直接或间接影响心血管系统、水盐代谢、骨质代谢及免疫和肌肉的适应性变化1 .有研究表明，PVN 在失J3重后加压素（AVP）功能发生变化，AVP 分泌增加，显示其对失重的反应2，3.但长期失重
5、后下丘脑功能活动是否有变化仍不清楚. 近年星形胶质细胞（AS）在神经系统中的作用已受重视，表现出多种结构和功能，与神经元间存在双向通讯，在神经系统功能活动中具有重要的作用4，5 .研究发现太空飞行 14d 大鼠海马内GFAP 表达明显减少6 ，但下丘脑部位 GFAP 表达有否变化及与神经元间的关系未见报道. 我们拟利用功能形态学的方法，观察 4wk 模拟失重大鼠下丘脑内Fos 和 GFAP 表达的变化，探讨下丘脑 PVN 和 SON 的神经元和AS 是否参与对失重的反应，并探讨二者之间的关系. 1 材料和方法 1.1 实验组 1.1.1 动物模型制备体质量 160g 左右的雄性 Spraque
6、-Dawley 大鼠（本校实验动物中心提供）.按体质量配对原则随机分为悬吊组与同步对照组各 6 只.悬吊组尾部悬吊按文献 7方法进行，动物在悬吊期间始终保持-30头低位及后肢悬空不负重.2 组分别单个饲养，每日摄入饲料成分与食量相当，饮水不限，室温保持在（232），人工控制动物室内照明，每昼夜均保持 12h 光照与黑暗循环交替，室内保持安静. J41.1.2 切片制备动物解除悬吊后立即在戊巴比妥钠（40mgkg-1，ip）深麻下开胸，经升主动脉插管，先以 100mL 生理盐水冲洗血液，继以含 40gL-1 多聚甲醛的 0.1molL-1 磷酸缓冲液（pH7.4）500mL，灌流 1.5h 以上
7、，注毕立即取脑置于 200gL-1 蔗糖溶液中过夜（4） ，至组织块沉底.下丘脑部位作冰冻连续冠状切片，片厚 30m，置于 10mmolL-1 的 PBS 中. 1.1.3 免疫组化反应（ABC 法）切片先入含 3gL-1TritonX-100 的 PBS 浸泡 30min（室温）.切片分为二组 :第一组:抗 Fos 蛋白免疫组化反应（ABC 法）:抗 Fos 蛋白免疫组化反应: 入兔抗 Fos抗体稀释液（11000，SantaCruz） ，孵育 48h（4）;生物素标记的羊抗兔 IgG（1500，Sigma） ，放置 2h（室温）;生物素-卵白素-HRP 复合物（ABC，1500，Sigma
8、） ，放置 2h（室温） ，最后用葡萄糖氧化酶-DAB-硫酸镍铵法呈色.以上每一步骤之后均用 PBS液充分漂洗 3 次，每次 10min（下同）.第二组:抗 GFAP 免疫组化反应: 入兔抗 GFAP 抗体稀释液（13000，Sigma） ，孵育48h（4）;生物素标记的羊抗兔 IgG（1500） ，孵育 2h（室温）;生物素 -卵白素-HRP 复合物（ABC，1500） ，孵育 2h（室温） ，最后用葡萄糖氧化酶-DAB-硫酸镍铵法呈色. 切片漂洗后裱片、晾干、脱水、透明和封固，光镜下观察并摄像. 1.2 对照组 J51.2.1 空白对照组（n=2）将上述环境下饲养的同步对照大鼠按上述方法麻
9、醉灌注取材切片，作抗 Fos 和抗 GFAP 免疫组化反应，以观察动物在基础状态下中枢神经系统内 Fos 和 GFAP 表达情况. 1.2.2 免疫组化染色替代实验取实验组大鼠部分延髓切片，用10mmolL-1PBS 分别取代抗 Fos 和抗 GFAP 抗体，再按 ABC 法进行免疫组化染色，结果为阴性. 2 结果 2.1 对照组 2.1.1Fos 阳性神经元其胞核为黑色，胞质为阴性，在PVN，SON 和 SCh 有少量分布（Fig1-A ，B ）. 2.1.2GFAP 阳性细胞上述核团 GFAP 阳性细胞表达较少（Fig2-A ，B ）.这些细胞的形态特点是胞体小，突起细而短. 2.2 实验
10、组 2.2.1Fos 阳性神经元集中在 PVN 的大小细胞部（Fig1-A ） ，尤其以腹侧大细胞部更明显（Fig1-A1） ，SON（Fig1-B ）和视交叉上核（SCh）均有大量表达. J62.2.2GFAP 阳性细胞主要特点是:与对照组比较，GFAP 阳性细胞胞体变大，突起变粗变长，形成一种肥大型的 AS;在上述Fos 表达阳性部位的 GFAP 表达数量均见明显增加（Fig2-A，B） ，表现出二者部位和范围的一致性. 3 讨论 3.1 模拟失重的动物模型尾部悬吊模型是由 NASA 提出的，近十年被广泛应用，较其他方法显示出其优越性，它既能模拟失重时的低运动负荷，又能模拟血液动力学的低动
11、力状态，陈杰等7对该方法进行了改进，研究结果表明该种方法可悬吊 120d，期间对大鼠的应激影响轻微，且出现血液向头部流动、血容量减少、后肢肌肉萎缩、骨机械性能变差等和其他一些生理性改变，类似于航天员失重引起的一些典型变化. 3.2Fos 蛋白和 GFAP 表达的意义 3.2.1 机体在失重状态下出现多种生理性变化除了各部承受载荷削减外，还出现体液及血液头向转移和重新分配，进而导致血量减少以及心血管系统适应低负荷状态的一系列调整变化将伴随失重状态的始终，这必然导致参与此状态下心血管调节的相应中枢部位J7神经元一直处于激活状态，用 Fos 表达可以显示出来.4wk 模拟失重大鼠中枢内可观察到多个部
12、位出现 Fos 表达，在下丘脑主要为PVN，SON 和 SCh 等，说明这些部位参与了对失重的反应.PVN 的大细胞部主要分泌加压素，而小细胞部则与心血管调节中枢几个重要的区域互相投射，包括 PBN，MVZ 各部及脊髓侧角交感节前神经元，本实验发现 PVN 大小细胞部、包括腹侧大细胞部出现大量的Fos 表达，这在出血或药物诱发的急性血压改变时未见到，结合SON 阳性神经元亦较多，提示失重状态下下丘脑一方面通过与其他心血管中枢联系尤其是与延髓间的神经调节通路，一方面通过释放加压素的神经内分泌体液调节通路，共同完成心血管功能调节以适应失重带来的变化，包括血液头向流动、全身低血容量等，这一结果与失重
13、状态下加压素分泌增加是一致的2，3 . 3.2.2Fos 和 GFAP 表达部位基本一致 GFAP 被认为是星形胶质细胞活化状态的标志之一，已广泛应用于生理刺激或病理状态的研究中8，9.我们在同一切片上同时观察神经元和 AS 的变化未见报道，它反应了兴奋性神经元和兴奋性 AS 的相互关系.本研究显示，4wk 模拟失重大鼠 GFAP 阳性表达细胞同 Fos 阳性神经元一样，在上述部位集中分布，明显多于对照组，表现为细胞增多，胞体变大，突起增粗增长，表明 AS 对模拟失重刺激起反应并表现出活化状态，显示出机能、部位的特异性.本研究显示 GFAP 表达的部位与Fos 蛋白表达的部位一致，提示 AS
14、可能参与中枢对失重状态下心血J8管功能的调控过程.从以上可以看出 GFAP 与神经元活动无论从部位上还是时间上都相吻合，二者在对模拟失重过程中以某种内在的协同或制约机制，共同完成对模拟失重的神经调节. 图 1图 2 略 3.3 下丘脑 Fos 表达的机制既往研究证实，A1，A2 区的去甲肾上腺素能神经元是延髓心血管中枢的重要组成部分，参与压力反射对血压的调控10 ，来自外周主动脉压力感受器的心血管冲动经 NTS 和 VLM 中继后上传到 PVN，调控其分泌机能11.LiYW 等证实外周血压改变可诱发 PVN 和 SON 大量 Fos 表达，且大部分为加压素能神经元，提示血压改变可激活 PVN
15、加压素神经元12 ，进而改变加压素的释放.研究表明失重状态下 A2 的去甲肾上腺素转运速度降低，说明 NTS（包括 A2）细胞群卷入了压力反射，由于心血管传入冲动发生改变，促使其调控中枢发生适应性改变2. 我们的研究结果亦提示，延髓内脏带内神经元参与模拟失重状态下心血管调控，且部分为儿茶酚胺能13 ，可以推测失重状态下的低血容量变化，血液在头部分布增加，头颈部血管跨壁压力加大14 ，压力感受器不断接受刺激并上传，一方面通过压力感受器反射通路影响交感神经输出;一方面经 NTS，VLM 上传给PVN，影响 AVP 合成和释放 ;同时 PVN 内 Fos 阳性神经元亦可能通过向延髓内脏带投射，调节压
16、力反射传入15 ，或通过 PVN 直接J9投射到脊髓交感节前神经元，影响交感输出. 参考文献: 1BlomqvistCG，BuckeyJC ，GaffneyFA，LaneLD ，LevineBD，WatenpaughDE.Mechanismsofpostflightorthostaticintoler-ance J.JGravitPhysiol，1994;1（1）:122-124. 2FagetteS，SomodyL，BouzeghraneF，CottetEmardJM，GharibC，GauquelinG.Centralandperipheralsympatheticac-tivitiesinr
