《槲皮素联合川芎嗪对小鼠Lewis肺癌生长的抑制作用》由会员分享，可在线阅读，更多相关《槲皮素联合川芎嗪对小鼠Lewis肺癌生长的抑制作用（12页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1槲皮素联合川芎嗪对小鼠 Lewis 肺癌生长的抑制作用作者：符慧群，李杰平，贺兼斌，张平 【摘要 】 目的 探讨槲皮素联合川芎嗪对小鼠 Lewis 肺癌生长的抑制作用及其机制。方法 复制 C57BL 小鼠 Lewis 肺癌模型，将 40只接种 Lewis 肺癌的 C57BL 小鼠随机分成 4 组：对照组（A 组） 、槲皮素组（B 组） 、川芎嗪组（C 组） 、槲皮素+川芎嗪组（D 组） ，每组 10 只。连续用药 20 日，观察移植瘤生长情况，于接种后第22 天处死各组小鼠，采用免疫组化半定量检测肿瘤组织微血管密度（MVD） 、血管内皮生长因子（VEGF ）及增殖核抗原（PCNA）的表达水平
2、，用原位凋亡 TUNEL 法检测肿瘤细胞凋亡指数（AI） 。结果 （1）B、C、D 组肿瘤的生长明显受到抑制，瘤重明显低于 A 组，其抑瘤率分别为 39.87%、35.45% 、54.58%，D 组抑瘤率明显高于 B、C 组，差异有显著性（P0.05 ） 。 （2）B、C、D 组MVD、VEGF 及 PCNA 表达水平明显低于 A 组（P0.05 或0.01） ，尤其是 D 组表达最低。B、C、D 组 AI 较 A 组增高（P0.05 或 0.01） ，D 组最高。结论 槲皮素与川芎嗪联合用药可明显抑制 Lewis 肺癌移植瘤的生长，其作用机制与抑制微血管生成、抑制细胞增殖和促进细胞凋亡有关。
3、 2【关键词】 槲皮素；川芎嗪；Lewis 肺癌；血管内皮生长因子；凋亡Abstract：Objective To explore the inhibitor effect and its mechanism of quercetin combination with tetramethylpyrazine on growth of lung carcinoma in mice. Methods The Lewis lung carcinoma models of C57BL mice were establish. Forty C57 BL mice were randomly divide
4、d into 4 groups: control group(Group A)，quercetin group (Group B)，tetramethylpyrazine group(Group C) and quercetin + tetramethylpyrazine group(Group D).Different treatments were served from day 2 after transplantation and all mice were sacrificed after 22 days. The volumes of tumors were measure res
5、pectively during the therapy time；subcutaneous tumors were processed for histological examination. The expression of microvessel density (MVD), proliferating cell nuclear antigen (PCNA) and vascular endothelial growth factor (VEGF) were detected by immunhistochemical method. The apoptosis index (AI)
6、 was measured by biotinyated dUTP nick and labeling (TUNEL). Results （1 ）The tumor growth was suppressed significantly in Group B,C and D. The weights 3of tumor were markedly decreased in Group B,C and D compared with Group A. Group B,C,D had a growth inhibition rate of 39.87%，35.45% and 54.58% resp
7、ectively.（2）The expression levels of VEGF，MVD and PCNA were significantly lower in Group B, C, D than group A. AI was enhanced in Group B,C,D，compared with Group A. Conclusion Quercetin combination with tetramethylpyrazine can remarkably inhibit the growth of Lewis lung carcinoma in mice, and its me
8、chanisms might be relative to inhibiting the angiogenesis and tumor proliferating and inducing apoptosis.Key words：Quercetin；Tetramethylpyrazine；Lewis lung carcinoma；Vascular endothelial growth factor；Apoptosis0 引言肺癌是当今世界上严重威胁人类健康与生命的恶性肿瘤，其发病率和死亡率都有明显增高的趋势，迄今尚无有效的治疗方法。近年来，从中药及天然植物中提取毒副作用低的抗肿瘤的有效成分，已
9、成为肿瘤治疗的新途径。槲皮素是天然黄酮类化合物，体外实验证实对白血病、前列腺癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、结肠癌等有抑制作4用1，2 。新近研究发现川芎嗪对肺癌新生血管有较强抑制效应3。因此，本实验研究槲皮素联合川芎嗪对小鼠 Lewis 肺癌生长的影响，并探讨其可能的机制。1 材料和方法1.1 药品与主要试剂盐酸川芎嗪注射液（TMP，40mg/2ml，批号 9803161）购于无锡市第七制药厂，丙二醇（分析纯）为重庆东方试剂厂生产，槲皮素购于美国 Sigma 公司，TUNEL 凋亡检测试剂盒、兔抗鼠PCNA 单抗及 SABC 免疫组化试剂盒购于武汉博士德生物工程有限公司，VEGF 兔抗鼠单抗购于美国
10、 Santa Cruz 生物科技公司，CD34 兔抗鼠一抗、 DAB 显色剂均购自福州迈新生物工程公司。1.2 模型制备与分组给药取接种 Lewis 肺癌 1014d 的 C57BL 荷瘤小鼠（购自中国科学院上海药物研究所） ，脱颈椎处死，无菌条件下取瘤组织，按肿瘤质量（g）与生理盐水（ml）13 制备匀浆液备用。另取 C57BL小鼠（购自中国医学科学院动物繁殖所）40 只，雌雄各半，体重1820g，每只小鼠于右腋皮下接种匀浆液，每只 0.2ml，建立小5鼠皮下肿瘤动物模型。40 只小鼠皮下移植处均成瘤，接种 2d 后随机分成 4 组，每组 10 只。对照组（A 组）：予丙二醇 0.2ml+生
11、理盐水 0.2ml 腹腔注射，1 次/d ；槲皮素组（B 组）：予槲皮素50mg/kg 溶于 0.2ml 丙二醇+生理盐水 0.2ml 腹腔注射，1 次/d； 川芎嗪组（C 组）：予川芎嗪 100mg/kg 溶于 0.2ml 生理盐水+丙二醇 0.2ml 腹腔注射，1 次/d ；槲皮素+ 川芎嗪组（ D 组）：予槲皮素 50mg/kg 溶于 0.2ml 丙二醇+川芎嗪 100mg/kg 溶于 0.2ml生理盐水腹腔注射，1 次/d。各组均连续给药 20d，第 22d 处死全部小鼠进行指标检测。1.3 一般检测接种前和接种后每 2d 称 1 次体重，按体重变化调整给药。接种后每 2d 测量 1
12、次小鼠皮下肿瘤最长径（a）和最短径（b ） ，计算肿瘤体积（V= ab2/2） ，绘制肿瘤生长曲线。第 22d 脱颈椎处死小鼠，完整剥离肿瘤称重，计算抑瘤率，抑瘤率=（1-治疗组平均瘤质量/对照组平均瘤质量）100% 。1.4 HE 及免疫组化染色取肿瘤组织，10%中性甲醛固定、石蜡包理，5m 连续切片，HE 染色，光镜观察。采用免疫组化 SABC 法检测血管内皮生长因子6（VEGF） 、增殖核抗原（PCNA）及肿瘤组织微血管密度（MVD）的表达，严格按照试剂盒说明书进行操作，阴性对照用磷酸盐缓冲液（PBS）代替一抗。VEGF 的判定标准：高倍镜下计数 100 个细胞，肿瘤细胞胞浆及胞膜中呈棕
13、黄色阳性细胞8 个红细胞直径的血管不计数。MVD 计数参考 Weidner 等4方法。1.5 肿瘤细胞凋亡用 TUNEL 原位凋亡法检测，方法步骤按试剂盒说明书进行，用已知的阳性片为对照。细胞核内出现棕黄色颗粒为阳性细胞,结果判断同 PCNA，计算凋亡指数(Apoptosis Index,AI)。1.6 统计学处理所有数据用s 表示，采用组间 t 检验，多样本均数间多重比较的方差分析及 q 检验，数据分析采用 SPSS10.0 统计软件完成，7P0.05 为差异有统计学意义。2 结果2.1 药物对肿瘤生长的影响接种后，成瘤率为 100%。各组皮下移植瘤的体积逐渐增大，肿瘤成局部结节状生长，接种
14、后的第 12d，移植瘤生长基本相同，第 1622d，对照组移植瘤生长明显快于其他组，联合组肿瘤生长最慢。各用药组对移植瘤生长均有抑制作用，以联合用药组更为明显。第 22d 后，各用药组肿瘤体积及瘤重均低于对照组（P0.05） ，见表 1。表 1 药物对移植瘤生长的影响( 略)注：A ：对照组，B：槲皮素组，C：川芎嗪组，D：槲皮素+川芎嗪组；与A 组比较 *P0.05，#P0.01，与 D 组比较$P0.052.2 移植瘤组织病理学观察移植瘤呈圆形、椭圆形或分叶状生长，质地硬，切面灰白，大部分与周围组织分界清楚。镜下移植瘤细胞形状不规则，大小不一，核大，浓染，核异形性明显，可见病理性核分裂相，
15、核质比例明显增大，并可见血管增生，以间质及肿瘤边缘为主。各组内均可见组8织坏死区，A 组相对较少。B、C、D 组癌细胞出现不同程度的退变，可见明显的坏死区，C、D 组间质中血管成分明显减少。2.3 药物对 VEGF、PCNA、MVD 表达及凋亡的影响表 2 各组 VEGF、MVD、PCNA 表达和凋亡指数(s)比较（略）注：与 A组比较*P0.05#P0.01，与 D 组比较$P0.05VEGF 主要表达于肿瘤细胞的胞浆及胞膜中，血管内皮细胞也见表达，呈棕黄色颗粒。B、C、D 组与对照组比较 VEGF 表达明显减少，差异有显著性（P0.01 ） ，D 组 VEGF 表达水平较 C、D 组降低（P0.05） 。所有肿瘤组织内 MVD 均阳性表达，内皮细胞被染成棕黄色。D 组与其他组相比 MVD 显著减小（P0.05） 。PCNA 表达于细胞核内而呈棕黄色颗粒，A 组绝大多数细胞核染成棕黄色，PCNA 增殖指数明显高于其他组（P0.05） ，D 组PCNA 增殖指数最低，与 B、C 组相比有显著性差异。TUNEL 染色凋亡细胞核亦呈棕黄色染色、未凋亡的细胞核呈蓝绿色。B、C、D组凋亡指数较 A 组明显增高（P0
