qPCR 常见问题及分析解决办法昆山吉和力仪器有限公司（以下简称“吉和力” ）是一家提供专业服务和仪器设备的集成供应商，公司以用户实际需求为导向，提供最合适、性价比最高的仪器，致力于打造一站式服务平台为了让业内人士对 qPCR 进行更加深入的了解，吉和力整理了一些相关常见问题，并对这些问题一一进行了解答 qPCR 的英文全称是 Real-time Quantitative PCR Detecting System，即实时荧光定量核酸扩增检测系统，也叫实时定量基因扩增荧光检测系统，简称 qPCR 简单来说，qPCR 就是利用荧光信号的变化，实时监测PCR 扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过 Ct 值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析而常规的 PCR无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时监测 如何提高 RT-PCR 反应的灵敏度与特异性？ ①确定模板 RNA 完整性，无 DNA 污染； ②RNA 模板中不应含有扩增反应抑制剂； ③为了防止模板降解，在反应体系中加入 RNase 抑制剂 RNasin； ④使用适量的模板 RNA，模板量太多会降低特异性，太少会导致扩增不出条带或条带太弱； ⑤若模板中有二级结构，可通过提高逆转录反应温度来提高扩增效果； ⑥设计引物时，避免在引物 3’端含有互补序列，避免形成内部发卡结构。
避免 RNA 降解的方法有哪些？ ①在用来验证完整性之前先在变性胶上分析 RNA； ②运用良好无污染技术分离 RNA； ③将组织从动物体取出后立刻提取 RNA，并将提取好的RNA 反转录为 cDNA 进行低温保存 RNA 中含有逆转录抑制剂时，怎么处理？ 逆转录抑制剂包括：SDS、EDTA、甘油、焦磷酸钠、亚精胺和胍盐，可将对照 RNA 与样品混合，同对照 RNA 反应比较产量以检测 RNA 抑制剂；若对照 RNA 与样品混合后产量降低，则说明样品中存在逆转录抑制剂，可用70%（v/v）乙醇对 RNA 沉淀进行清洗，以除去抑制剂 如何减少 RNA 模板中的二级结构？ ①将 RNA 和引物在不含盐及缓冲液条件下变性、退火，提高逆转录反应温度； ②温度超过 60℃时，不能使用 oligo（dT）引物，选择一个在反应温度可以退火的 GSP； ③RT-PCR 产物的长度超过 1kb 时，反应温度需保持在65℃ RNA 中有 DNA 污染的处理方式 ①若是基因组 DNA 的污染，可使用 DNaseI 处理 RNA，同时设置没有逆转录对照组反应检测 DNA 污染； ②若是受到外源 DNA 的污染，可使用抗气雾剂和 UDG酶。
qPCR 探针设计的一般原则有哪些？ ①扩增片段的长度不应太大，一般小于 300bp； ②探针不能和任一引物互补，且其长度在保证特异性的前提下尽可能的短，长度不要超过 30bp； ②探针的 Tm 值至少比引物的 Tm 值高 5 度； ③探针如用于检测多态位点，多态位点应尽可能靠近探针中部； ④探针 5’端不能是碱基 G，G 对荧光基团有猝灭作用无反转录酶情况下，对照 RNA 仍有扩增结果 ①体外转录时不可能将所有 DNA 模板消除，因而对照组会含有痕量的 DNA建议可将第一链 cDNA 稀释1：10、1：100、1：1000 倍以消除 DNA 污染造成的影响； ②可能是引物二聚体的条带 扩增产物滞留在加样孔中 ①可能是由于模板量过高而导致 PCR 结果产生了高分子量的 DNA 胶状物，建议将第一链 cDNA 浓度稀释至 100 倍再进行二次扩增； ②在二次 PCR 时，使用的退火温度如果比引物的 Tm 值低 5℃，可将退火温度适当增高或进行热启动以提高特异性无 Ct 信号出现 ①反应循环参数不够，一般要在 35 个循环以上，但是过多的循环次数可增加背景值； ②检测荧光信号的步骤有误SYBRgreen 法（SG 法）采用的是 72℃延伸时采集荧光信号，taqman 法则是在退火结束或延伸结束时进行信号采集； ③引物或探针降解，可用 PAGE 电泳检测其完整性，若是电泳条带呈弥散状，可考虑重新合成引物或探针； ④模板不足或降解，则可以重新提取核酸模板。
Ct 值出现过晚（Ct>38） ①扩增效率低，反应条件不够优化，降低退火温度，增加镁离子浓度； ②反应成分降解或加样量不足； ③PCR 产物过长，一般采用 80-150bp 标准曲线线性关系不佳 ①加样存在误差，是样品浓度不成梯度； ②标准品出现降解，避免反复冻融； ③引物或者探针设计不佳； ④模板中存在抑制物或模板浓度过高 溶解曲线存在多个主峰 ①引物设计不够优化； ②引物浓度不佳，上下游引物浓度比例不一致； ③镁离子浓度过高； ④模板基因组的污染 同一样品中，其中某一个荧光信号特别强 ①试剂配制时反应液没有完全溶化，导致探针量在一管增多； ②试剂配制时没有充分混匀致各管中各成分的量不同；③PCR 仪热槽被荧光物质污染，需要清除热槽中的污染扩增曲线有一向上或向下的尖峰？ ①反应过程中电压不稳定； ②可能在 20 个循环左右时，仪器有停下或仪器有开盖，使光线突然增强； ③如果尖峰向下，可能是由卤素灯老化所致，这时应更换 部分样本扩增效率过低？ ①提取液残留，一定程度抑制了 PCR 反应； ②反应液未严格取量混匀或分装不均匀； ③试剂失效 阴性对照或空白对照翘尾 ①模板提取环境或操作过程有污染； ②配液过程存在污染。
直线型扩增曲线 ①探针部分降解：一般稀释的探针可在 4℃保存至少 3个月，探针的反复冻融或导致降解；或者探针在光线下暴露时间太长了； ②反应液中有 PCR 抑制物 没有扩增曲线 ①PCR 参数设置错误，在设计循环参数时将荧光信号读取时?g 设在反应的第一步，即 stage1 阶段； ②电脑设定了自动休眠 基线下滑 基线选取范围不对，可试着将基线范围改大一些，这一问题常因试剂质量所致 扩增曲线断裂 基线选取范围不对，基线终点大于 Ct 值，这通常是由于模板 DNA 浓度过高所致，因 Ct 值。