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1、1核酸扩增技术 (NAT)在血液 HBV DNA 筛查中的应用研究【关键词】核酸扩增技术(NAT) 血液 HBVDNA 筛查 输血相关传染病的预防和控制已成为全社会关注的焦点，随着检测技术的不断进步，输血传播相关病毒的危险性大大降低，目前酶免疫检测(ELTSA) 技术已经广泛应用于血液筛查，但每年仍有少量新发输血后肝火病例报道，如美国无偿献血者每单位供血传播 HBV 的危险性为 16.3 万。这些危险主要来自病毒感染者“窗口期”献血、病毒变异、低病毒载量感染及人工操作失误等，其中“窗口期”漏检是影响血液安全性的主要问题。核酸扩增技术(NAT)可直接检测病毒核酸，大大缩短病毒 ELISA 检测的
2、窗口期及检出变异株，发达国家已陆续将其纳入献血者的常规筛查项目，并取得一定的成效。但由于进口 NAT 试剂成本很高，取制了该技术在我国血液常规筛查中的推广应用。为了进一步提高血液的安全性，降低血液核酸筛查的成本，笔者尝试将国产 NAT 试剂应用到血液 HBVDNA 筛查中，并对在献血者 HBVDNA 检测中建立一套适合中国国情的筛查检测体系的可行性进行了探讨。 1 材料和方法 1.1 材料 RSP-200(瑞士 TECAN)及 STAR2000 全自动上海加样仪(瑞士HAMILTON)，MicrolabFAME(瑞士 HAMILTON)和2DADEBehring 全自动酶免分析仪(德国 DAD
3、E)，KHB-DP1000 磁珠分离仪(上海科华 )， MJOpficon2 核酸扩增检测仪(美国 Biorad)，专用耗材-96Plate，专用耗材 -96TipComb，核酸提取试剂盒(上海的华)，HBV 检测试剂盒，HBVDNA 国家标准品(卫生部临检中心，浓度 3600IUml)，HBsAgELISA 国产试剂(上海科华) 和进口试剂(美国 Abbott)，乙肝两对半试剂 (厦门新创 )。 1.2 检测对象 2008 年 8 月2009 年 12 月无偿献血者标本共 9239 份。NAT筛查的标本用真空 EDTA 抗凝留取血样 5ml，于 8h 内分离血清。 1.3 血液的 ELISA
4、 常规检测 所有标本均经乙肝金标试纸条和 ALT 试纸条筛查合格后，再进行HBsAg、抗 -HCV、抗-HIV 国产和进口试剂两遍 ELISA 筛查及梅毒、ALT 检测。 1.4 标本的汇集 将采集的 5mlEDTA 抗凝的全血室温离心 3min(3600g)，保存24冰箱中，待血液标本 ELISA 常规筛查合格后，应用STAR2000，启动全自动汇集程序，按试剂盒要求进行 8 人份标本汇集，将每个汇集池的标本知码文件储存并输出以备追溯和确认使用。若汇集样经检检测为阳性，进行单个标本检测，以最终确认阳性标本。 1.5 标本的浓缩 往每个汇集池中加入浓缩液 40l 和促沉剂 50l，充分混匀后在
5、3Eppendort 离心机以 4 离心 1 小时(2500026000g)，留底部110l 左右样震荡混匀备用。 1.6 核酸的提取 采用核酸提取试剂盒，在标本处理区按试剂盒要求准备六块板，板加去抑制剂 20l、浓缩样 100l、裂解液 100l 及专用耗材-96TipComb，板加磁珠溶液 100l，板分别加洗涤液 A、B、C200l，板加洗况液 80l，然后在 KHB-DP1000磁珠分离仪上按程序说明逐步完成核酸提取。 1.7 核酸扩增及检测 用全自动核酸扩增仪检测，按检测试剂盒要求准备 PCR 反应液(HBVPCR 反应液 A：HBVPCR 反应液 B：HBVPCR 反诮液 C：内标
6、=8：6：1：0.2) ，往反应管中加 15lPCR 反应液及 15l 已提取的核酸,置入核酸扩增检测仪上，按程序操作。内标阳性，样本阳性者报阳性。 2 结果 2.1 灵敏度考评 将已知浓度的标准品用阴性血清于不同时间配制成不同拷贝数的应用标准液，进行重复核酸提取、扩增及检测，结果见表 1。 应用 Probit 概率统计(SAS9.0) 计算 95检测限量及可信限范围。本方法检测 HBVDNA95检测限量为 98.0IUml，可信限范围为455.8，548 。 2.2 已知 HBVDNA 阳性标本检测结果对 7 份 已知 HBVDNA 阳性的保存标本 (经 Roche 试剂检测阳性)分别取样
7、1200l 离心浓缩后进行核酸提取扩增检测和 100l 直接进行核酸提取扩增检测，结果分别检也 HBVDNA 阳性 6 例和 5 例，检出率分别为 85.7、72.4。采用随机双盲法混合了 7 份阳性血清(经单人份检测阴性) ，进行混样检没， 7 例混样中共检出 HBVDNA阳性 2 例，检出为 28.6，见表 2。 阳性、定量测定无结果 2.3 检测系统的精密性 对 68 次扩增实验的质控的 CT 值进行统计分析：计算前 20 个质控点：均值 x-=30.081，SD=1.051 ，CV=3.49 。除了一次实验失控，CT 值CT 值过高可能是质控样提取的核酸不足，导致扩增循环次数增加所致，
8、其他实验质控艾在 x-2S 范围内，见图 1。 2.4 质量控制 为监控实验进行，对整个实验进行有效控制，在每次检测过程依靠阴性、阳性对照、质控及内标进行监控。阳性质控品用来监测试剂以及实验室环境是否存在污染等可引起假阳性的系统误差及系统5错误，以减少假阳性。阳性质控品用来监测试剂及整个实验过程产生假阴性的系统误差及系统性错误，以减少假阴性。内标是相当于加入每管中的阳性质控，监测每个反应体系产生假阳性的偶然误差及个体性错误，以减少标本的假阴性。阴性对照采用科华公司提供的阴性稀释血浆，质控品由科华公司提供(5104 拷贝ml) ，以阴性血浆稀释成 150 拷贝ml，随样本一起检测，内标能被扩增出
9、来，阳性对照、质控均能定性检出阳性。 2.5NAT 检测结果 共对血清学筛查合格血液 9239 人份计 1157 个汇集标本进行扩增检测，初检发现 HBVDNA 阳性汇集标本 6 个，对所有初检阳性的汇集标本进行复检，结果全部阴性，假阳性率为 0.52，本次实验未检出 HBVDNA 阳性标本。从检测阴性谍集标本中随机进行单份检测(1400l 上样浓缩)，共检测 234 份，亦未检出 HBVDNA 阳性标本，见表 3。 *1157 个汇集池中有 6 个汇集池不是按 8150l 方案汇集，其中 3 个汇集池是 4150l，另外 3 个分别是6150l、 3150l、 2150l。在进行 HBVDN
10、A 检测，有 1个内标检出失败。 2.6HBsAgELISA 阳性献血者中 HBVDNA 检测结果 对同期经 ELISA 筛查 HBsAg 阳性的标本共计 36 份进行检测，检6出 HBVDNA 阳性 22 例，阳性率 61.1，对所有 HBsAg 阳性标本进行两对半检测，结果见表 4。同时对初检单试剂 (ABBOTY)检测HB-sAg 阳性的 11 份标本做确认实验，结果均呈阳性反应。 3讨论 血液 HBV 筛查模式的选择取决于该地区 HBV 的流行率，一般流行率较低的地区如欧洲、美国(3)主要规定对献血员进行HBsAg 和抗 -HBc 两项筛查，而流行率高的地区比如新加坡、台湾，由于献血人
11、群中 HBcAb 阳性率较高，对血液 HBV 筛查只检测HBsAg 和 ALT 两项，这两种筛查模式，都能使输血传播 HBV 的危险性大大降低。但由于 HBV“窗口期” 、病毒变异、低滴度感染及ELISA 试剂灵敏度的原因， ELISA 法筛查并不能根本排除病毒存在的危险，研究表明 HBsAg 阴性、抗-HBc 阳性的健康人群中有约10HBVDNA 阳性，抗-HBs 和抗-HBc 阳性的健康人群中有515 HBVDNA 阳性，尽管血清中病毒载量较低。而 HBsAg和抗-HBc 联合检测也并不能消除 HBV“窗口期 ”造成的漏检，资料显示 HBV 感染后最先存在血清中 HBVDNA，而就算用灵敏
12、度较高的 ELISA 试剂检测抗检测抗体也要经过 20-30 天的窗口期，因此对献血员 HBV 筛查迫切需要一种更为有效的方法，比如将可直接检测该毒核酸的 NAT 技术引入到血液常规筛查中。国外目前所开展的血液核酸筛查都是在 ELISA 筛查的基础上进行的，本次实验通过对ELISA 检测 HBsAg 阳性标本 36 份进行 HBVDNA 检测，检出率761.1，并对所有 HBsAg 阳性标本进行两对半检测，结果两对关检测提示具传染性的一些标本未检出 HBVDNA 阳性，可能是病毒载量低于方法的检测限量，表明在目前情况下应考虑 ELISA 和 NAT检测方法同时检测血液。目前开展血液 HBVDN
13、A 常规筛查的主要有德国和日本，他们分别采用的是 96 人份和 20 人份混合检测方案，多年来筛查 HBV 阳性率分别是 1108000 和 153976，显然HBV 中等浪行地区的 HBsAg 阴性、HBVDNA 阳性检出率较 HBV低流行地区要高，调查显示 HBV 高流行地区的 HBsAg 阴性、HBVDNA 阳性检出较 HBV 中等流行地区和低流行地区都要高。 我国是乙型肝炎的高度流行区，最近两年调查数据显示，人群中HBsAg 携带率已上升至 10.12，在这种乙肝高流行区人群中征集健康它全的医疗用血是相当困难的，目前我国血站的血液筛查都是使用 ELISA 方法，而我国的抗 -HBc 阳
14、性率高达 60，对献血员的筛查主要检测 HBsAg 和 ALT 两项，由于该方法的灵敏度较低 (国产试剂盒灵敏度为 0.5-1.0ngml)及病毒“窗口期”变异等原因，使得血液筛查存在一定程度的漏检，给临床用血安全带来极大的威胁。NAT 技术可直接检测病毒核酸，能缩短“窗品期”和检测病毒变异株，大大降低了 HBV 的漏检率。 血清学检测 HBsAg 阴性不能排除 HBV 感染已经成为共识，1978 年 Hooftingle 等首次报告抗-HBc 阳性、 HBsAg 阴性的供血者可导致受血者 HBV 感染以后，大量文献报道证明了这种现象确实存在，引起输血传播 HBV 的主要是 HBsAg 阴性、
15、HBVDNA 阳性8的献血者，有研究报告在 HBV 暴露率高达 7090的地区，献血员中有 719为 HBsAg 阴性 HBV 感染者，而在 HBV 暴露率低的西方国家如美国约 5，献血员中仅 09为 HBsAg 阴性 HBV 感染者。HBsAg 阴性 HBV 感染者的血清病毒一般保持低水平复制，抗原表达量低，HBVDNA 通常104IUml，目前所用ELISA 试剂灵敏度难以检出。有研究证明 HBsaAg 阴性 HBVDNA阳性血 18可导致输血后乙肝感染，而已有报道人隐匿性 HBV 感染者克隆出来的 1 个到 10 个病毒颗粒接种到猩猩身上可复制出典型 HBV 感染临床表现，因此尽快推行血
16、液核酸筛查是避免输血后HBV 感染的有效措施。 本实验对经过 ELISA 筛查合格的献血者 9239 份标本共计 1157汇集样进行 HBVDNA 检测，结果未检出阳性标本，对从阴性谍集标本中随面拆分的 234 份标本进行单份检测，结果亦未检出HBVDNA 阳性标本。原因可能有几个因素；无尝献血的组织动员工作保证了从低危人群中采血，血源质量高，不仅已实现 100无尝献血，而且定期献血者占献血人数 50以上，占采血量64，是严格实施了免疫筛查，两次 ELISA 检测分别采用国产和灵敏度很高的进口度剂；是所采用的 NAT 试剂灵敏度与国际同等水平相比较低，日本红十字会与 Roche 合作利用 TaqManPCR，建立的全自动血液核酸常规筛查，其报告的 HBVDNA 灵敏度为 30 拷贝ml。本实验对 7 份已知 HBVDNA
